一种石斛单细胞悬浮培养的方法技术

本发明专利技术属于植物细胞生物工程领域，具体涉及一种石斛单细胞悬浮培养的方法。包括一种细胞培养液，及用该细胞培养液培养石斛细胞的方法。细胞培养液的组分为：1/2MS、MES、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、CaCl2、1gBSA、土壤滤液，超纯水定容至1L；土壤滤液制备方法为：取普通土壤浸泡于蒸馏水中24h，浸泡后过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液，将上清液再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，并将该上清液过滤即得。

【技术实现步骤摘要】
一种石斛单细胞悬浮培养的方法
本专利技术属于植物细胞生物工程领域，具体涉及一种石斛单细胞悬浮培养的方法。
技术介绍
石斛为兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw.)植物，其茎段为传统中药材，在《中华人民共和国药典(2015年版)》等中皆有收录。在《神农本草经》中,石斛被列为上品,具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。现代药理研究表明,其化学成分类型主要有生物碱类、酚类、多糖类等,其中生物碱类为主要成分。石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、抗白内障和抗菌等作用。因此，现代中医药界对石斛的研究逐渐重视起来。植物细胞的单细胞悬浮培养技术能够在短时间内获得大量的植物细胞，目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作。另一方面，大量获得的具有相同遗传背景的植物悬浮培养细胞，可以为植物次生代谢产物的获取，以及植株的再生提供大量优质的原材料。以往对石斛细胞悬浮培养的报道，都只集中于对石斛原球茎进行悬浮培养，缺乏对石斛的单细胞悬浮培养研究。这主要是因为使用原球茎进行悬浮培养相对容易，如果直接选取石斛成体的一部分(如茎段、叶片等)分离并培养单细胞，缺乏相关文献报道支持，而不同植物的单细胞培养方法不尽相同，直接将其它植物的细胞培养方法移植过来，石斛单细胞的提取率、存活率都非常低，即使存活，后续生长效果也不理想，无法在短时间内快速获得大量细胞并加以利用。因此，研发一种存活率和获得率高的悬浮培养石斛单细胞的方法，对石斛进一步的科学研究、次生代谢产物生产、大规模无性繁育等，具有重要的科研价值和现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种悬浮培养石斛单细胞的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种细胞培养液，按重量份数，总量为1000份，包括如下组分：100～120份1/2MS、1.1份MES、30份蔗糖、100份葡萄糖、100份甘露醇、1.48份CaCl2、1份BSA、土壤滤液20～25份，余量为超纯水；所述土壤滤液制备方法为：取普通土壤浸泡于蒸馏水中24h，浸泡后过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液，将上清液再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，过滤，即得。优选的，所述土壤滤液的上清液过滤时，过滤孔径为0.45μm。相应的，所述细胞培养液在培养石斛细胞中的应用。相应的，一种以所述细胞培养液培养石斛细胞的方法，包括如下步骤：(1)石斛预处理：破碎石斛，消毒、洗净；(2)按权利要求1的方法制备不含土壤滤液的细胞培养液，得甘露醇培养液；将所述预处理后的石斛置于甘露醇培养液中，按重量比，石斛：甘露醇培养液＝1～3：50，4℃暗处理1h；(3)将暗处理后的石斛取出置于酶液中，黑暗震动酶解4h，按质量比，所述石斛：酶液＝0.1～2:11；所述酶液的组分按重量份数为：39份MES，149份KCl，729份甘露醇，100份纤维素酶，40份果胶酶，50份离析酶，10份牛血清白蛋白，11.1份CaCl2；将所述酶液各组分完全溶解于水中，混匀并经0.22μm过滤后，即得酶液；(4)将酶解出的石斛细胞清洗和重悬3～5次，得纯化石斛单细胞悬液；(5)将上述纯化石斛单细胞悬液加入所述石斛细胞培养液中，按体积比，所述纯化石斛单细胞悬液：石斛细胞培养液＝1:20，室温下100rpm摇床培养至细胞增殖即可。优选的，步骤(1)的消毒方法为：将所述石斛置于浓度为75％的酒精中浸泡15s，再放入0.1％升汞溶液中浸泡10min。相应的，所述细胞培养液在冻存石斛细胞中的应用。相应的，一种利用所述细胞培养液制备的石斛细胞冻存液，由所述细胞培养液和甘油按体积比为9:1组成。相应的，一种利用所述细胞培养液冻存石斛细胞的方法，包括如下步骤：(1)制备细胞冻存液：将所述细胞培养液和甘油按体积比为9:1混匀制得；(2)使用所述细胞冻存液将石斛细胞进行重悬，重悬后石斛细胞浓度为1～3×106个/mL；(3)将所述重悬后的石斛细胞4℃处理15min～30min，再在-80℃条件下处理24～720h，得冷冻处理后的石斛细胞；(4)将所述冷冻处理后的石斛细胞迅速转入液氮中，封存，即冻存完成。优选的，步骤(3)进行4℃处理后，先用棉花包裹在装有重悬后石斛细胞的容器外壁，再进行-80℃处理。相应的，一种复苏上述所冻存的石斛细胞的方法，包括如下步骤：(1)取出冻存的石斛细胞，快速放入37℃水浴加热环境并加热至冻存液完全融化，得初步复苏的石斛细胞；(2)使用所述细胞培养液重悬初步复苏的石斛细胞，重悬后细胞浓度为1～3×106个/mL，得石斛细胞悬液；(3)将所述石斛细胞悬液放入所述细胞培养液中，石斛细胞悬液与细胞培养液的体积比为1:40，室温下摇床培养至细胞增殖，即完成石斛细胞的复苏工作。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术可以在没有完整植株的情况下，只使用石斛成体的一部分(如茎段、叶片、原球茎等)即可分离单细胞并进行悬浮培养，并可在短时间内获得大量具有相同遗传背景的石斛单细胞。该方法细胞获得率高、体外培养扩增快、易于长期保存、复苏后生长状况良好。2、本专利技术并非是只针对某种特定石斛的获取和培养方法，而是对石斛属植物都具有普遍适用性，可实际应用到生产中。3、本专利技术通过短期内快速获得大量石斛体细胞的方法，为石斛的进一步科学研究、此生代谢产物生产、大规模无性繁育等提供了有力支撑。附图说明图1为金钗石斛单细胞悬浮培养照片；图2为金钗石斛细胞悬浮培养生长曲线；图3为铁皮石斛单细胞悬浮培养照片；图4为铁皮石斛细胞悬浮培养生长曲线；图5为迭鞘石斛单细胞悬浮培养照片；图6为迭鞘石斛细胞悬浮培养生长曲线。具体实施方式一、本专利技术涉及的试剂：1、酶液：先将0.2mol/LMES1mL，0.8mol/LKCl2.5mL，0.8mol/L甘露醇5mL，100mg纤维素酶，40mg果胶酶，50mg离析酶，置于烧杯中混匀并完全溶解,加蒸馏水定容至10mL，55℃水浴10min；冷却后加入10mg/mL牛血清白蛋白1mL(下述简称BSA)，0.25mol/LCaCl2400μL，再次混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤器将混合液过滤至无菌离心管中，即得酶液约11mL。2、清洗液：1.1gMES，5.94gKCl，1.48gCaCl22H2O，101mgKNO3，50g甘露醇，加入超纯水充分溶解后定容至1L，采用NaOH溶液或稀盐酸调节溶液pH为5.8～6.0，121℃、0.1MPa高温高压湿热灭菌20min，冷却即得。3、培养液：90mL1/2MS(由常规MS培养基的大量元素减半得到，也可直接购买固体1/2MS溶解后获得，因市购或自配的1/2MS成分略有不同，所以密度不尽相同，最终90mL约为100～120g)、1.1gMES、30g蔗糖、100g葡萄糖、100g甘露醇、1.48gCaCl2、1gBSA、土壤滤液20mL，加入超纯水充分溶解后定容至1L，用0.22μm无菌滤膜过滤器将混合液过滤至无菌离心管中储存。其中，所述土壤滤液为：取普通土壤30g置于50mL离心管中，往离心管中加入蒸馏水并震荡，使土壤悬浊液总体积为50mL,静置浸泡24h；浸泡后将其用滤纸过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液；将上清液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞培养液，其特征在于：按重量份数，总量为1000份，包括如下组分：100～120份1/2MS、1.1份MES、30份蔗糖、100份葡萄糖、100份甘露醇、1.48份CaCl2、1份BSA、土壤滤液20～25份，余量为超纯水；所述土壤滤液制备方法为：取普通土壤浸泡于蒸馏水中24h，浸泡后过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液，将上清液再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，过滤，即得。

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养液，其特征在于：按重量份数，总量为1000份，包括如下组分：100～120份1/2MS、1.1份MES、30份蔗糖、100份葡萄糖、100份甘露醇、1.48份CaCl2、1份BSA、土壤滤液20～25份，余量为超纯水；所述土壤滤液制备方法为：取普通土壤浸泡于蒸馏水中24h，浸泡后过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液，将上清液再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，过滤，即得。2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于：所述土壤滤液的上清液过滤时，过滤孔径为0.45μm。3.权利要求1或2所述细胞培养液在培养石斛细胞中的应用。4.一种以权利要求1或2所述细胞培养液培养石斛细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)石斛预处理：破碎石斛，消毒、洗净；(2)按权利要求1的方法制备不含土壤滤液的细胞培养液，得甘露醇培养液；将所述预处理后的石斛置于甘露醇培养液中，按重量比，石斛：甘露醇培养液＝1～3：50，4℃暗处理1h；(3)将暗处理后的石斛取出置于酶液中，黑暗震动酶解4h，按质量比，所述石斛：酶液＝0.1～2:11；所述酶液的组分按重量份数为：39份MES、149份KCl、729份甘露醇、100份纤维素酶、40份果胶酶、50份离析酶、10份牛血清白蛋白、11.1份CaCl2；将所述酶液各组分完全溶解于水中，混匀并经0.22μm过滤后，即得酶液；(4)将酶解出的石斛细胞清洗和重悬3～5次，得纯化石斛单细胞悬液；(5)将上述纯化石斛单细胞悬液加入所述石斛细胞培养液中，按体积比，所述纯化石斛单细胞悬液：石斛细胞培养液＝1:20，室...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡亚东，淳泽，刑嘉懿，刘静，赵若茜，郑世刚，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51