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一种基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用制造技术

技术编号:19447909 阅读:211 留言:0更新日期:2018-11-14 17:06
本发明专利技术公开了一种基因工程菌及其在制备L‑草铵膦中的应用。该基因工程菌包括大肠杆菌和转入大肠杆菌的重组质粒,所述重组质粒包含转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因;所述转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2~5所示。本发明专利技术利用基因工程技术,通过在大肠杆菌中表达核糖‑5‑磷酸途径合成的关键基因PdxST,或增强大肠杆菌自身PLP合成途径关键基因epd,pdxJ和dxs的表达,构建得到辅酶强化的转氨酶基因工程菌,不仅显著提高了胞内辅酶PLP的含量,使该基因工程菌在生产L‑草铵膦时无需添加外源PLP,而且还显著提高了转氨酶的酶活和稳定性,延长了转氨酶的半衰期,降低了生产成本,提高了L‑草铵膦的生产效率。

【技术实现步骤摘要】
一种基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用
本专利技术属于微生物
,尤其涉及一种基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用。
技术介绍
转氨酶(EC2.6.1.X)是一类催化氨基转移作用的酶,能够催化氨基供体(氨基酸或胺)上的氨基转移到前手性的受体酮或酮酸上,得到手性胺或手性氨基酸,以及副产物酮或酮酸(图1),因其具有高选择性、高转化率和温和的反应条件赢得了广大研究者的青睐。使用转氨酶催化合成R-西他列汀(SavileCK,JaneyJM,MundorffEC,MooreJC,TamS,JarvisWR,ColbeckJC,KrebberA,FleitzFJ,BrandsJ,DevinePN,HuismanGW,HughesGJ.Biocatalyticasymmetricsynthesisofchiralaminesfromketonesappliedtositagliptinmanufacture.Science2010;329:305-309.)已经实现工业生产。使用转氨酶能够催化合成多种手性胺如S-利斯的明(FuchsM,KoszelewskiD,TauberK,KroutilW,FaberK.Chemoenzymaticasymmetrictotalsynthesisof(S)-Rivastigmineusingω-transaminases.Chemicalcommunications2010;46:5500.),R-或S-美西律(Koszelewski,Dominik,Pressnitz,Desiree,Clay,Dorina,Kroutil,Wolfgang.DeracemizationofMexiletineBiocatalyzedbyω-Transaminases,OrganicLetters,2009;11:4810-4812)和手性氨基酸如L-草铵膦(KBartsch,RDichmann,PSchmitt,EUhlmannandASchulz,StereospecificProductionoftheHerbicidePhosphinothricin(glufosinate)byTransamination:IsolationandCharacterizationofaPhosphinothricin-specificTransaminasefromEscherichiacoli[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1990,56:1-6.,)L-高苯丙氨酸(Hsueh-HsiaLo,Shih-KuangHsu,Wei-DeLin,Nei-LiChan,Wen-HweiHsu,AsymmetricalSynthesisofl-HomophenylalanineUsingEngineeredEscherichiacoliAspartateAminotransferase[J].Biotechnologyprogress,2005,21:411-415)等关键药物手性中间体或手性化学品。目前,已知的转氨酶都需要磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶,PLP是最通用的辅酶之一,以PLP为辅酶的酶包括转氨酶,脱羧酶,裂解酶,醛缩酶,消旋酶等,在生物体中起到关键作用,参与包括脱羧、转氨、消旋、断裂Cα-Cβ键和α,β-消除反应等超过160种酶促反应,占目前已知细胞中全部反应的4%。国际上,SchulzA等人(StereospecificProductionoftheHerbicidePhosphinothricin(glufosinate)byTransamination:IsolationandCharacterizationofaPhosphinothricin-specificTransaminasefromEscherichiacoli[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1990,56:1-6.)(美国专利US5221737)早在上世纪90年代就利用转氨酶生产L-草铵膦;BartschK(美国专利US6335186B1)在上述单酶反应体系下,增加一个谷氨酸-草酰乙酸转氨酶,组成双转氨酶偶联反应体系;BartschK等随后在中国申请的专利(中国专利CN1349561A)中又提出了利用谷氨酸-草酰乙酸转氨酶,直接利用L-天冬氨酸为氨基供体制备L-草铵膦。这些涉及转氨酶的反应中,均需要在体系中加入磷酸吡哆醛(PLP,0.01-0.1mM)作为辅酶,保证转氨反应的正常发生。国内,杨立荣等在中国申请的专利(公开号CN105603015A,CN106916857A和CN107119084A)均涉及转氨酶在制备L-草铵膦中的应用,反应体系中也都需要加入磷酸吡哆醛(PLP,0.1-1mM),因此辅酶磷酸吡哆醛(PLP)是转氨酶催化过程中的必要因素。重组转氨酶的基因工程菌株胞内自身合成的PLP无法满足转氨酶高效转化的要求。其部分原因是大肠杆菌合成PLP主要依赖1-脱氧-5-磷酸木酮糖途径,该途径需要7种酶的参与,合成效率较低,但增强其中关键基因的表达可能提高吡哆醛的含量(专利WO2004029271A1);相比较下,生物体内存在广泛存在于真菌、植物及部分原核生物细胞中的PLP从头合成途径,底物是细胞中较充足的核糖-5-磷酸、甘油醛-3-磷酸和谷氨酰胺,且仅需要两个酶参与,即PdxS(又称YaaD、Pdx1或SnzP)和PdxT(又称YaaE、Pdx2或SnoP),且该路径已应用于1,5-戊二胺的合成(CN106148373A,Engineeringapyridoxal5’-phosphatesupplyforcadaverineproductionbyusingEscherichiacoliwhole-cellbiocatalysis[J],ScientificReports,2005,5(1):1-10)。L-草铵膦,英文名为:L-Phosphinothricin(简称L-PPT),一般是指化合物2(S)-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸(PPT)或其与碱性化合物形成的盐(如式(2)所示),是由赫斯特公司于80年代开发的(后归属于拜耳公司)广谱触杀型除草剂的有效成分,其除草活性为市场上销售的外消旋混合物(如式(1)所示)的2倍,且在土壤中易分解,对人类和动物的毒性较小,除草谱广,对环境的破坏力小。目前,在L-草铵膦的制备工艺中,为了能够降低生产成本,如何能够在不加入外源PLP的情况下,也能保证转氨酶的正常催化,提高L-草铵膦的生产效率,是研究者们的一个研究方向。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基因工程菌及其在制备L-草铵膦中的应用,通过构建能够在大肠杆菌胞内大量表达磷酸吡哆醛(PLP)且不影响转氨酶活性的基因工程菌,来解决现有技术中手性氨基酸制备过程中需要外源加入磷酸吡哆醛(PLP)的问题,大大降低生产成本。具体技术方案如下:本专利技术提供了一种基因工程菌,包括大肠杆菌和转入大肠杆菌的重组质粒,所述重组质粒包含转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因;所述转氨酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;所述磷酸吡哆本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种基因工程菌,包括大肠杆菌和转入大肠杆菌的重组质粒,其特征在于,所述重组质粒包含转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因;所述转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2~5所示。

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌,包括大肠杆菌和转入大肠杆菌的重组质粒,其特征在于,所述重组质粒包含转氨酶基因和磷酸吡哆醛合成途径酶基因;所述转氨酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2~5所示。2.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述重组质粒由包含转氨酶基因的表达载体I和包含磷酸吡哆醛合成途径酶基因的表达载体II组成。3.如权利要求2所述的基因工程菌,其特征在于,所述表达载体I为pET28或pCDFDuet;所述表达载体II为pCDFDuet或pACYC。4.如权利要求2所述的基因工程菌,其特征在于,所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.5所示;所述表达载体I为pET28,所述表达载体II为pCDFDuet。5.如权利要求2所述的基因工程菌,其特征在于,所述磷酸吡哆醛合成途径酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示;所述表达载体I为pCDFDuet,所述表达载体II为pACYCDuet。6.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述重组质粒由同时包含转氨酶...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨立荣蒙丽钧周海胜刘亚运尹新坚徐刚吴坚平
申请(专利权)人:浙江大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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