一种减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术提供的铜绿假单胞菌基因工程菌是铜绿假单胞菌中控制绿脓菌素合成的phz操纵子及其操纵子拷贝双缺失突变失活得到的减毒菌株。所述phz操纵子是由phzA、phzB、phzC、phzD、phzE、phzF和phzG七个基因组成的毒力岛，命名为phzA1‑G1；及其操纵子拷贝命名为phzA2‑G2。本发明专利技术提供的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌，其代谢过程中无绿脓菌素产生，并且无抗性基因标记。本发明专利技术的基因工程菌可用于鼠李糖脂的大规模生产及多环芳烃、石油烃污染等环境污染物的生物修复中。

【技术实现步骤摘要】
一种减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及基因工程菌株
，特别涉及一种减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌及其构建方法和应用。技术背景铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是土壤中存在的最常见的假单胞菌之一。铜绿假单胞菌是条件致病菌，它的致病性很大程度上取决于其产生的多种毒性因子。吩嗪类物质是铜绿假单胞菌中重要的毒性因子，包括：吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid，PCA)、绿脓菌素等。绿脓菌素是铜绿假单胞菌所特有的蓝色吩嗪类化合物，是重要的吩嗪类复合物和毒性因子，与囊肿性纤维化(cysticfibrosis，CF)病人的肺部感染有关。绿脓菌素是PCA的代谢产物，而phz操纵子是PCA的合成基因。铜绿假单胞菌分泌的毒性因子导致其在实际应用过程中引起安全和健康问题，从而限制了它的应用价值。铜绿假单胞菌是最主要的鼠李糖脂生产者。鼠李糖脂是微生物在特定条件培养时分泌的具有表面活性的一类代谢产物。与化学表面活性剂相比，鼠李糖脂生物表面活性剂具有无毒、易被生物降解、高效的起泡性、良好的破乳性等优点，被广泛用于环境污染治理、石油开采、生物医药、造纸及化妆品等领域，具有广阔的应用前景。在化妆品领域用于制造具有皮肤亲和性和保湿作用脂质体；在食品领域，用作可消化、抑菌的食用香料及果蔬的保鲜、防腐剂等。但铜绿假单胞菌本身所具有的致病性，可能在鼠李糖脂的大规模生产和应用过程中引起安全和健康问题。同时，铜绿假单胞菌是公认的多环芳烃污染修复细菌。多环芳烃(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是一类含有两个或两个以上苯环，以线性排列、弯接或者簇聚等不同方式排列形成的有机化合物，对生态环境和人类健康造成很大的威胁。高分子有机燃料(石油、煤焦油、化石燃料等)的不完全燃烧、熏制或烘烤食品等人为原因，是公认的环境多环芳烃的主要污染来源。由于多环芳烃分子结构复杂、热稳定性强、很难被氧化、水溶性差且具有极强的“三致”效应，其控制与修复已成为当前急需解决的重要环境问题之一。而假单胞菌(Pseudomonas)以其代谢速度快、环境适应强、可专一性代谢土壤中的有机污染物，将其转化为二氧化碳和细胞其它碳基大分子，成为多环芳烃生物修复的主要菌种之一。与传统的物理、化学方法相比，具有不可比拟的优势。但铜绿假单胞菌由于自身所分泌的毒性因子，有可能成为再次污染环境的源头而限制了其在环境生物修复中的应用。如何降低铜绿假单胞菌本身的毒性，使其发挥鼠李糖脂生产及生物修复等各个方面广泛的优势，已成为本领域研究者所争相探索的课题。然而真正能够构建出的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌少之又少【1】【2】【3】。目前尚无针对绿脓菌素这一重要毒性因子有效减毒的基因工程菌株构建的报道。同时由于在基因工程菌株构建中常使用抗性基因标记进行筛选，而抗性基因被视为一种新型的环境污染物，且易在水平方向转移，使得这一课题的研究难上加难。
技术实现思路
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌，其代谢过程中无绿脓菌素产生，并且无抗性基因标记，该工程菌可用于鼠李糖脂的大规模生产及多环芳烃、石油烃污染等环境污染物的生物修复中。本专利技术提供的一种减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌，所述基因工程菌是铜绿假单胞菌中控制绿脓菌素合成的操纵子及其操纵子拷贝双缺失突变失活得到的减毒菌株。所述控制绿脓菌素合成的操纵子为phz操纵子及其操纵子拷贝。所述phz操纵子是由phzA、phzB、phzC、phzD、phzE、phzF和phzG七个基因组成的毒力岛，命名为phzA1-G1；及其操纵子拷贝命名为phzA2-G2。本专利技术所述的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：1)将基因phzA1-G1上游与下游同源臂片段分别与质粒pEX18Amp连接，获得基因敲除载体pEX-phzA1-G1；2)将基因敲除载体pEX-phzA1-G1电转至铜绿假单胞菌DN1菌株感受态细胞，经过同源重组两次筛选，获得单突变株DN1-ΔphzA1-G1；3)将基因phzA2-G2上游与下游同源臂片段分别与质粒pEX18Amp连接，获得基因敲除载体pEX-phzA2-G2；4)将基因敲除载体pEX-phzA2-G2电转至铜绿假单胞菌DN1-ΔphzA1-G1菌株感受态细胞，经过同源重组两次筛选，获得双突变株DN1-Δphz。所述基因phzA1-G1的基因敲除引物phzA1-G1-up和phzA1-G1-down分别为：SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4。所述敲除后验证引物phzA1-G1为:SEQIDNO.9-10。所述基因phzA2-G2的基因敲除引物phzA2-G2-up和phzA2-G2-down分别为：SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8。所述敲除后验证引物phzA2-G2为:SEQIDNO.11-12。所述敲除引物扩增产物是待敲除基因上游与下游各2kb左右大小的同源臂片段，验证引物扩增产物是待敲除基因内的一部分片段。通常基因敲除中使用抗性基因标记进行筛选，而抗性基因被视为一种新型的环境污染物，同时抗性基因易在水平方向转移。本专利技术所提供的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌是以不加抗性基因标记的基因敲除方法构建，不造成环境污染。本专利技术还提供所述减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌在工业生产鼠李糖脂中的应用。同时，本专利技术还提供所述减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌在环境多环芳烃或石油烃分解与去除中的应用。优选为，所述减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌在分解与去除环境中荧蒽的应用。本专利技术减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，具体说明如下：本专利技术的铜绿假单胞菌DN1菌株是从石油污染土壤中分离获得；大肠杆菌DH5α在敲除载体构建中起辅助作用，购买自天根生化科技有限公司；本专利技术选用含有sacB蔗糖致死基因的质粒pEX18Amp进行铜绿假单胞菌中目的基因的敲除，由TungT.Hoang实验室提供。首先，构建基因敲除载体pEX-phzA1-G1，制备铜绿假单胞菌DN1菌株感受态细胞。基因敲除载体pEX-phzA1-G1通过电转化法导入至铜绿假单胞菌DN1菌株感受态细胞，经过同源重组两次筛选，PCR扩增并经电泳验证无条带即为DN1-ΔphzA1-G1菌株。然后，构建基因敲除载体pEX-phzA2-G2，并制备铜绿假单胞菌DN1-ΔphzA1-G1菌株感受态细胞。最后，基因敲除载体pEX-phzA2-G2再经电转化法导入至铜绿假单胞菌DN1-ΔphzA1-G1菌株感受态细胞，经过同源重组两次筛选，电泳验证均无条带即为DN1-Δphz菌株。本专利技术技术方案的有益效果在于：1.本专利技术构建的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌，消除了铜绿假单胞菌的毒性因子绿脓菌素；通过小鼠毒性实验证实该基因工程菌对小鼠毒害作用明显降低。2.本专利技术构建的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌发酵液的细胞毒性实验证实，该基因工程菌能够降低工业应用过程中的毒性，可用于鼠李糖脂的大规模发酵生产。3.本专利技术构建的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌在代谢多环芳烃、石油烃的过程中不产生绿脓菌素。4.本专利技术构建的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌，在以50μg/mL荧蒽为唯一碳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是铜绿假单胞菌中控制绿脓菌素合成的操纵子及其操纵子拷贝双缺失突变失活得到的减毒菌株。

【技术特征摘要】
1.一种减毒的铜绿假单胞菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是铜绿假单胞菌中控制绿脓菌素合成的操纵子及其操纵子拷贝双缺失突变失活得到的减毒菌株。2.按照权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述控制绿脓菌素合成的操纵子为phz操纵子及其操纵子拷贝。3.按照权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述phz操纵子是由phzA、phzB、phzC、phzD、phzE、phzF和phzG七个基因组成的毒力岛，命名为phzA1-G1；及其操纵子拷贝命名为phzA2-G2。4.按照权利要求1所述的减毒铜绿假单胞菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：1)将基因phzA1-G1上游与下游同源臂片段分别与质粒pEX18Amp连接，获得基因敲除载体pEX-phzA1-G1；2)将所述基因敲除载体pEX-phzA1-G1电转至铜绿假单胞菌DN1菌株感受态细胞，经过同源重组两次筛选，获得单突变株DN1-ΔphzA1-G1；3)将基因phzA2-G2上游与下游同源臂片段分别与质粒pEX18Amp连接，获得基因敲除载体pEX-phzA2-G2；4)将基因敲除载体所述pEX-phzA2-G2电转至所述铜绿假单胞菌DN1-ΔphzA1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：马艳玲，黄朝，李艳鹏，孔伟娜，薛姝雯，陈富林，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61