本发明专利技术涉及一种内源L‑门冬酰胺酶II基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用。具体而言，本发明专利技术涉及一种敲除大肠杆菌内源L‑门冬酰胺酶II基因的方法，并获得敲除该基因的宿主菌株。利用打靶载体敲除的方式，所述宿主菌基因组不含有编码L‑门冬酰胺酶II及其变体的基因。采用本发明专利技术提供的宿主菌，可以重组表达欧文氏菌、埃希氏菌等不同微生物来源的L‑门冬酰胺酶II及其变体。
【技术实现步骤摘要】
一种内源L-门冬酰胺酶II基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用
本专利技术涉及生物制药领域，具体涉及一种敲除内源性L-门冬酰胺酶II基因的大肠杆菌宿主菌株的制备方法及该宿主菌株的应用。
技术介绍
L-门冬酰胺酶II是一种能催化门冬酰胺水解生成门冬氨酸和氨的脱氨酶。该酶能去除细胞外的L-门冬酰胺，从而阻止依赖于L-门冬酰胺进行蛋白质合成的癌细胞的生长。在临床上，L-门冬酰胺酶II主要用于治疗急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤。目前市场上的L-门冬酰胺酶II制剂来源于两种微生物，即大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)和欧文氏菌(Erwiniachrysanthemi)，L-门冬酰胺酶II为相同亚单位的四聚体，分子量为141kDa，单体无酶活性。这两种来源的L-门冬酰胺酶II较少出现交叉过敏反应，根据欧盟肿瘤研究所的临床研究，两种酶的疗效接近，但29％的白血病患者对大肠埃希氏菌来源的L-门冬酰胺酶II有严重过敏反应，必须用菊欧文氏菌来源的L-门冬酰胺酶II治疗才能取得满意疗效。因此，欧文氏菌来源的L-门冬酰胺酶II可以作为多药化疗方案的组分，适用于治疗对埃希氏菌来源的L-门冬酰胺酶II有超敏反应的急性淋巴细胞白血病患者。专利CN101083118B从大肠埃希氏菌中提取天然的L-门冬酰胺酶II，发酵液产量为10单位/mL。专利CN101831417A与专利CN1397645A提供了一种从欧文氏菌体中提取天然L-门冬酰胺酶II的方法，发酵液产量为50-80单位/mL。从上述两种菌种获得天然目的蛋白，产量低，经济效益差。通过基因工程技术，可以工业化大规模重组表达L-门冬酰胺酶II。Mojtaba等人(2011BihareanBiologist.5(2):96-101)利用BL21(DE3)重组表达大肠埃希氏菌的L-门冬酰胺酶II，产量可达到130单位/mL，吴敬等人(2000中国药学杂志.35(4):268-272.)重组表达大肠埃希氏菌AS1.357的L-门冬酰胺酶II，产量可达到214单位/mL。但是大肠杆菌能够本底表达L-门冬酰胺酶II，所获得的L-门冬酰胺酶II产品混有大肠杆菌本底表达的L-门冬酰胺酶II，导致产品纯度的不均一，有潜在的免疫原性安全风险。另外杂质也可能导致人体对药物形成免疫，导致治疗失败。专利CN101484181A为了解决这个问题，在BL21(DE3)宿主菌中，使用游离的重组表达载体生产BL21来源的L-门冬酰胺酶II，从而获得均一纯度的L-门冬酰胺酶II，但是，这种策略也存在ansB基因及宿主菌基因组不稳定性的风险。2000年KirillA.等人(2000PANS.97(12):6640-6645.)发现，利用与宿主菌目标基因的同源序列片段或质粒，通过同源重组的方式使目标基因被替换或者插入大肠杆菌基因组，从而使大肠杆菌目标基因失去活性。但游离的重组表达载体中含有的ansB基因(L-门冬酰胺酶II基因)与大肠杆菌基因组上的ansB基因高度同源，极有可能发生同源重组，导致宿主菌基因组结构改变及基因活性丧失，不能持续稳定表达L-门冬酰胺酶II。为了解决上述ansB基因及宿主菌基因组不稳定性的风险，我们通过基因敲除技术，将大肠杆菌自身的L-门冬酰胺酶II基因(ansB)进行敲除，使之不能表达自身的L-门冬酰胺酶II。但是，并非所有细菌的任何基因都能够成功的进行基因敲除，对细菌的基因敲除技术难点在于影响重组效率的因素很多，例如细菌种属、亚型，被敲除的基因，感受态细胞状态，操作方法等不同，重组效率差异很大(张雪等,2008中国生物工程杂志.28(12):89-93.)。另外，打靶载体的打靶序列选择不当，也会导致重组效率很低而敲除失败，合适的打靶序列及打靶载体至关重要。本专利技术提供的打靶载体含有sacB基因，不会在基因组上留下任何外源片段的残留，不会影响基因组后续的遗传操作及残留的外源片段可能造成的同源重组而导致的基因不稳定性。在本专利技术一个优选的实施方案中，采用本专利技术提供的打靶载体，首次在BL21(DE3)菌株中成功进行了无痕敲除ansB基因。使用本专利提供的宿主菌，可以避免游离重组表达载体中的ansB基因与宿主菌基因组上的ansB基因发生同源重组而导致的ansB基因及宿主菌基因组不稳定性，另外，使用本专利提供的宿主菌，可以重组表达欧文氏菌、埃希氏菌等不同微生物来源的均一纯度的L-门冬酰胺酶II及其变体，满足临床上多药化疗方案组合的需求。
技术实现思路
本专利技术提供一种敲除内源L-门冬酰胺酶II基因的方法，并获得敲除该基因的大肠杆菌(大肠埃希氏杆菌，E.coli)宿主菌株，其中所述的宿主菌基因组不含有编码内源L-门冬酰胺酶II及其变体的基因。在本专利技术一个优选的实施方案中，本专利技术所述的宿主菌，其中所述宿主菌是通过打靶载体敲除细菌中编码L-门冬酰胺酶II的表达功能框获得，所述打靶载体包含的打靶序列为SEQIDNO:1，序列如下：GCAATCTGGTGATCACGCCAGACGGCAACGTGATGTATAACGGTAAGCAATATTCCCTGAATGCCGCCCAGCGCGAGCAGGCGAAGGATTATCAGGCTGAACTACGCAGCACGCTGCCGTGGATTGATGAAGGCGCGAAAAGCCGCGTCGAAAAAGCCCGTATTGCGCTGGATAAAATTATCGTTCAGGAGATGGGCGAAAGCAGCAAAATGCGCAGCCGTCTGACCAAACTTGATGCGCAGCTGAAAGAGCAGATGAACCGCATTATCGAAACGCGCAGCGATGGCCTGACGTTTCACTATAAAGCCATTGATCAGGTTCGCGCCGAAGGCCAGCAATTAGTGAATCAGGCAATGGGCGGAATTTTACAGGACAGCATTAATGAAATGGGCGCGAAAGCGGTGCTGAAAAGCGGCGGTAACCCATTACAGAACGTGCTGGGAAGCCTGGGCGGCCTGCAATCCTCAATCCAAACCGAGTGGAAAAAGCAGGAAAAAGATTTCCAGCAGTTTGGCAAAGATGTTTGTAGCCGCGTTGTGACTCTGGAAGATAGCCGCAAAGCCCTGGTCGGGAATTTAAAATAATCCTCTATTTTAAGACGGCATAATACTTTTTTATGCCGTTTAATTCTTCGTCACTTCGCCCCGGTATCGTGCCGGGGCTTATTCACTTCAGACTCACGTCCATTGCCAATTTTTATTACCCTAATGATAATCACCGGAATAAATTATTCCGCGCGAGGGTTTTCGGGTGAAAAAGCAATGGATTGTTGGTACGGCGCTGCTTATGTTGATGACTGGTAATGTCCGGGCAGATGGTGAACCGCCAACTGAAAATATCTTAAAAGATCAATTCAAAAAGCAGTATCACGGCATTCTCAAGCTTGATGCCATCACCTTAAAAAATCTTGATGCTAAGGGTAATCAGGCCACCTGGTCAGCGGAAGGCGATGTC本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种内源L‑门冬酰胺酶II基因敲除的大肠杆菌，其特征在于所述大肠杆菌基因组不含有编码内源L‑门冬酰胺酶II及其变体的基因。
【技术特征摘要】
2017.04.26 CN 20171028150491.一种内源L-门冬酰胺酶II基因敲除的大肠杆菌，其特征在于所述大肠杆菌基因组不含有编码内源L-门冬酰胺酶II及其变体的基因。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于所述大肠杆菌选自大肠杆菌BL21(DE3)、BLR(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami(DE3)、JM109、HSM174(DE3)、AS1.357和DH5α菌株；优选大肠杆菌BL21(DE3)。3.根据权利要求1所述内源L-门冬酰胺酶II基因敲除的大肠杆菌，其特征在于所述编码内源L-门冬酰胺酶II及其变体的基因被敲除，所述敲除的技术选自自杀质粒介导的基因敲除、CRISPR/Cas9介导的基因敲除、Red/ET重组介导的基因敲除、II型内含子插入介导的基因敲除、Cre-LoxP重组介导的基因敲除、TALEN基因打靶、RNA干扰；优选自杀质粒介导的基因敲除或CRISPR/Cas9介导的基因敲除。4.根据权利要求3所述内源L-门冬酰胺酶II基因敲除的大肠杆菌，其特征在于所述大肠杆菌是通过打靶载体敲除细菌中内源L-门冬酰胺酶II基因的表达功能框，优选敲除内源L-门冬酰胺酶II基因表达功能框的编码序列、启动子序列或信号序列。5.根据权利要求1所述内源L-门冬酰胺酶II基因敲除的大肠杆菌，其特征在于所述打靶载体包含如SEQIDNO:1所示的打靶序列或与SEQIDNO:1具有90％相似性的打靶序列，优选具有95％相似性的打靶序列，最优选具有99％相似性的打靶序列。6.一种重组表达外源基因的大肠杆菌，其特征在于利用权利要求1-5所述内源L-门冬酰胺酶II基因敲除的大肠杆菌进一步包含表达外源基因产物的多核苷酸；所述的多核苷酸选自通过游离于所述大肠杆菌基因组的重组表达载体表达，或通过定点整合到所述大肠杆菌基因组上表达，优选通过所述重组表达载体表达。7.根据权利要求6所述重组表达外源基因的大肠杆...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾杰，田静，陈磊，刘衍伟，王宏伟，
申请(专利权)人：江苏恒瑞医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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