一株解鸟氨酸拉乌尔菌PS及其在石油降解中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株解鸟氨酸拉乌尔菌PS及其在石油降解中的应用，通过16S rRNA基因序列扩增和测序，发现PS菌株的16S RNA序列长度为1375 bp，测序后序列提交GenBank。比对分析后，该菌株与解鸟氨酸拉乌尔菌相近，将该菌命名为解鸟氨酸拉乌尔菌PS，该菌株可用于石油降解。

【技术实现步骤摘要】
一株解鸟氨酸拉乌尔菌PS及其在石油降解中的应用
本专利技术属于环境微生物
，特别是涉及一株解鸟氨酸拉乌尔菌新菌株，以及其在石油降解中的应用。
技术介绍
石油是目前环境中广泛存在的污染物之一，包括汽油、煤油、柴油、润滑油、石蜡和沥青等，是多种烃类(正烷烃、支链烷烃、环烷烃、芳烃)和少量其他有机物。随着经济的发展，人类对能源的需求不断扩大，石油已成为人类最主要的能源之一。随着石油产量和需求的不断提高，冶炼、储存、运输等环节泄漏所造成的水体、土壤和大气等环境污染相应突出。石油进入土壤后与土粒粘连，土壤结构被破坏，降低土壤的透气性和渗水性。目前，国内外石油污染土壤修复技术按其性质可分为3种：物理方法、化学方法和生物方法。石油污染的生物修复，是指利用处理系统中生物(主要是微生物)的代谢活动来减少污染现场污染物的浓度或使其无害化的过程，其最终产物是CO2、H2O等物质。与物理、化学修复技术相比，具有多种优点：成本低；对人和环境造成的影响小；污染物氧化完全。微生物的生物降解效果受许多因素的影响，如温度，pH值，营养物，氧，培养基组成，污染物的浓度和生物利用度。关于石油类降解微生物已有一些报道,但符合实际应用要求的菌株还有待不断的开发和研究。
技术实现思路
从浙江工业大学校园土壤样品中分离获得一株石油降解菌解鸟氨酸拉乌尔菌PS。通过16SrRNA基因序列扩增和测序，发现PS菌株的16SRNA序列长度为1375bp，测序后序列提交GenBank(登录号KY464986)。比对分析后，该菌株与解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)相近,，将该菌命名为解鸟氨酸拉乌尔菌PS(RaoultellaornithinolyticaPS)。该菌株保藏号：CCTCCNO：M2018151，已保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏时间为2018年03月25日。进一步的研究发现，该菌株可用于石油降解。附图说明以下结合附图和本专利技术的实施方式来作进一步详细说明图1为菌株PS的透射电子显微镜(LB琼脂平板，30℃培养24h)；图2为接种菌株PS对MSM培养基中原油的降解效果(左侧为接种PS菌株的实验组，右侧为不接种PS菌株的对照组)；图3为在添加和不添加酵母提取物的情况下，菌株PS在培养液中的原油降解结果柱状图；图4为摇瓶培养20天后MSM培养基中残留原油GC-MS图；图3、图4中：A、无菌对照；B、无酵母提取物添加；C、添加酵母提取物。生物材料保藏信息：解鸟氨酸拉乌尔菌PS(RaoultellaornithinolyticaPS)于2018年03月25日在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号CCTCCNO：M2018151。具体实施方式材料与方法1.样品的来源石油降解菌从来自中国杭州的浙江工业大学朝晖校区(30°17'40“N-120°9'38”E)，大约16厘米深的土壤样品中分离得到。土壤具有粉质壤土质地，pH值为5.98。2.培养基的配制无机盐培养基(MSM)：K2HPO40.5g，MgSO4.7H2O1g，CaCl2.6H2O0.01g，Na2SO42g，NH4Cl1g，蒸馏水1L，pH6，115℃高压蒸汽灭菌30min。固体培养基需加入20g琼脂。LB培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10g，蒸馏水1L，pH7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。固体培养基需加入20g琼脂。无机盐含石油固体培养基：无机盐培养基50ml，石油0.5g，固体培养基需加入琼脂20g3.仪器UV-1000紫外分光光度计；双层全温恒温培养摇床；AgilentTechnologies5975C系列GC/MS等。4.石油降解菌株的筛选在500ml烧杯中的新鲜土壤(200克)中加入石油原油。使原油的浓度为120mg/g土壤。然后用保鲜膜覆盖烧杯并在18-20℃培养箱中培养22天。22天后将土壤悬液涂布在LB固体培养基上，30℃孵育24小时后，将LB上生长的菌落洗脱并与无菌MSM混合。将5ml该溶液接种到含有50mlMSM液体培养基和1ml石油原油的烧瓶中。以不接种的培养基为对照。在30℃，180rpm条件下培养10天。在MSM中的三次传代培养后，将1ml来菌液涂布在无菌MSM固体平板上，倒置后在平板盖上加入0.5ml石油。以未接菌的平板为对照。在30℃倒置培养2-5天。挑取在MSM琼脂上表现出良好且持续生长的菌株。5.石油降解菌株的鉴定根据Bergey的系统细菌学手册(Brenneretal.2005)确定菌株PS的生理和生物化学特征。使用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3')通过PCR扩增约1500bp的DNA片段,上海英捷维基生物技术有限公司进行测序，并使用www.ncbi.nlm.nih.gov/blastBLAST分析结果。基于16SrRNA基因测序，分析菌株进化地位。6.石油降解率的GC-MS测定发酵后，残留的石油用GC-MS定量。将烧瓶中的全部培养基与20ml正己烷混合，然后将混合物转移到分液漏斗中，并在室温下提取含有正己烷和残余原油的上层液体。用微量进样针取样lμl，GC-MS(Agilent5975C)进行组分分析。运行条件：载气：He；柱溢：80℃，恒温4min，以5℃/min升至250℃，保持10min；恒压不分流；进样口温度：200℃；检测器温度：250℃；扫描范围40-400amv；电子量70ev；载气流速：lmL/min；离子源温度：200℃；传输线温度：200℃。通过将质谱图库中每个分子的保留时间和质谱与参考数据相匹配(Royetal.2014)，确定了与色谱图上出现的不同峰相对应的原油中的成分。原油降解率(以总峰面积的减少来计算)使用下式估算(Santisietal.2015)：P(％)＝100-(AT×100/AC)其中AT是每个处理中峰的总面积，AC是对照中峰的总面积。结果：1.石油降解菌株的筛选和鉴定通过富集驯化以及多次传代培养和筛选，从浙江工业大学朝晖校区的土壤分离获得了一株高效石油降解菌株，在含石油的平板和摇瓶中都能很好的生长。将它命名为PS。菌株PS是革兰氏阴性需氧不能运动的好氧包囊杆状细菌。菌株的生理生化试验结果见表1。透射电子显微镜观察细菌直径约0.2-1.0μm(图1)。表1:石油降解菌株PS的生理生化特征注：“+”为阳性结果，“-”为阴性结果。括号中为酵母鉴定手册中的结果通过16SrRNA基因序列扩增和测序，发现PS菌株的16SRNA序列长度为1375bp，测序后序列提交GenBank(登录号KY464986)。比对分析后，该菌株与解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)相近，将该菌命名为解鸟氨酸拉乌尔菌PS(RaoultellaornithinolyticaPS)。该菌株已送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏(保藏号：CCTCCM2018151)。PS菌株接种至含原油的无机盐培养基，同时设置不接种PS菌株对照，结果(如图2所示)显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.解鸟氨酸拉乌尔菌PS (Raoultella ornithinolytica PS) CCTCC M2018151。

【技术特征摘要】
1.解鸟氨酸拉乌尔菌PS(Raoultellaornithinolytica...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟卫鸿，玛丽，邵云海，金维华，黄海婵，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33