温度敏感型siRNA纳米凝胶载体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种温度敏感型siRNA纳米凝胶载体及其制备方法。本发明专利技术的温敏阳离子纳米凝胶特点在于：采用了烷氧醚树枝化基元作为温敏基元，具有较高的温度敏感性和接近人体体温的相变温度，以及良好的生物相容性；其次同样采用树枝化结构的阳离子氨基基元，使其具有对于siRNA的更强的吸附能力。因此，合成的纳米凝胶其可以有效的实现siRNA的结合和保护作用，并在此基础上通过温度开关实现对siRNA的结合和释放功能的调控。本实验为该材料在生物材料、siRNA递送和基因治疗领域等方面的应用具有指导意义。

【技术实现步骤摘要】
温度敏感型siRNA纳米凝胶载体及其制备方法
本专利技术涉及一类温度敏感型siRNA纳米凝胶载体及其制备方法与应用。
技术介绍
RNA干扰是生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA启动的序列特异的转录后基因沉默过程，通过导入外源或内源的双链RNA（dsRNA），细胞内加工后可以特异性阻滞基因的表达，使内源性信使RNA（mRNA）发生特异性降解，从而引起转录后基因沉默。其具体的作用机制为前体RNA经过一种核糖核酸酶切割，形成长度为21-23个碱基对序列的双链小RNA分子或者是直接插入人工合成的类似长度的siRNA,在细胞内经过RNA诱导沉默复合物的识别后，siRNA中的正义链被去除，反义链与含其序列互补的mRNA进行结合，从而引起目的基因的降解。但是，siRNA由于其在体内易被核酸酶分解、细胞吸收效率低等因素导致其难以独立完成基因治疗的任务，因此优异的siRNA载体材料近年来受到科学家的广泛关注。并且由于非病毒载体具有低的免疫反应，对结构和功能具有更好的调节能力，合成较为简单和材料来源广泛等优点，也是在siRNA的递送中作为载体展现出了非常良好的潜力。而近年来针对其非病毒载体的研究主要包括阳离子纳米凝胶载体。纳米凝胶是一种以水为分散介质通过物理或化学交联形成的具有溶胀性且内部具有三维网状结构且直径在200纳米以下的纳米结构，而且具有血液循环时间长、生物相容性好及生物可降解性等优点。阳离子纳米凝胶载体由于可通过静电作用与siRNA结合且由于“质子海棉效应”的存在使其具有较好的细胞内化和溶酶体逃逸的能力，相较与其他非病毒载体具有较好的细胞转染能力，所以利用它作为载体是目前聚合物载体研究的热门。随之也可以通过对凝胶进行表面修饰制备出具有刺激响应性的可生物降解的纳米凝胶，因此纳米凝胶成为siRNA载体研究的又一大热点。Ahmed等以具有温敏效应的阳离子单体为核心和以具有良好生物相容性和可降解性的含糖共聚物为壳形成阳离子多糖纳米凝胶，并且对这俩种单体使用对酸不稳定的交联剂进行可控活性自由基聚合使得该凝胶同时具有温度和pH双重响应的机制，有效地提高了siRNA递送效率，且将这种阳离子凝胶与细胞内皮生长因子siRNA结合能够有效抑制人类宫颈癌细胞表面65%的细胞内皮生长因子。该方法有效地结合了天然多糖类聚合物和人工合成聚合物的优势大大提高了转染效率，为后续的研究提供了良好的思路（M.Ahmed,etal.PolymChem.2013,4,3829-3836）。近年来，一方面我们对siRNA递送过程各个阶段中的种种障碍有了一定的了解，也产生了很多对提高各个阶段效率的方法，但是这样的策略结合到一起往往却是相矛盾的，例如对载体表面聚乙二醇修饰可以提高血液流通时间却会降低转染能力，所以近年人们逐渐集中投身对于刺激响应性“智能载体”的研究当中。但是由于人体对于温度响应的灵敏性较低，因此，人们对于温度敏感性的siRNA载体缺少足够的研究研究。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一类温度敏感型siRNA纳米凝胶载体。本专利技术的目的之二在于提供该载体的制备方法。本专利技术通过分子设计制备出以具有优异温敏行为以及良好生物相容性的烷氧醚树枝化基元为基础，并且引入树枝化阳离子基元分别通过沉淀聚合方式得到具有一定拓扑结构的新型阳离子树形纳米凝胶。研究制备的新型阳离子树形纳米凝胶能够借助树枝化烷氧醚基元优异的温敏特性和拓扑结构，实现以温敏调控的手段实现对siRNA的结合和释放。本专利技术采用氨基封端树枝化基元为氨基基元单体，与一代烷氧醚树枝化单体发生沉淀聚合反应，合成具有温度响应性的阳离子纳米凝胶。该共聚物和纳米凝胶在相变温度以下可以实现对siRNA的吸附和免受核酸酶的降解，温度上升到相变温度以上可以实现对siRNA的释放。基于上述原理，本专利技术采用下述技术方案：一种温度敏感型siRNA纳米凝胶载体，其特征在于该载体是由采用氨基封端烷氧醚树枝化基元为氨基基元单体与烷氧醚树枝化单体，通过交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，由引发剂偶氮二异丁脒盐酸盐引发自由基聚合应，形成的具有拓扑结构的温度响应性阳离子纳米凝胶，其中氨基封端烷氧醚树枝化基元和烷氧醚树枝化单体的摩尔比为1:5~1:20，交联剂为单体总摩尔量的4%~6%，引发剂的量为单体总质量的0.4%~0.6%；所述的氨基封端烷氧醚树枝化基元的结构式为：或；所述的烷氧醚树枝化单体或其中Y=MeO或X=EtO；X=NH3+。一种制备上述的温度敏感型siRNA纳米凝胶载体的方法，其特征在于该方法的具体合成步骤如下：a.将含有叔丁氧羰基的树枝化烷氧醚单体MG1-OEt和三氟乙酸按1:50~1:100的质量比溶于二氯甲烷中，常温反应3~4h，结束后，向反应溶液中加入甲醇溶解，并蒸干甲醇，抽真空得到氨基封端烷氧醚树枝化基元；b.将步骤a所得氨基封端烷氧醚树枝化基元和烷氧醚树枝化单体按1:5~1:20的摩尔比溶于二氯甲烷中，加入交联剂和表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵，其中交联剂为单体总摩尔量的4%~6%，表面活性剂的质量为单体总质量的8~10%；在惰性气氛保护下，60~65oC并稳定30min，并加入引发剂偶氮二异丁脒盐酸盐体系，引发剂的质量为单体总质量的0.4%~0.6%；搅拌反应3~4h，反应液冷却至室温后，通过0.45μm,Rephile的尼龙滤膜，然后使用截留分子量为10000的透析袋纯化透析5天，得到纳米凝胶。一种上述的温度敏感型siRNA纳米凝胶载体的应用，其特征在于：在相变前对siRNA进行更高效的吸附和对siRNA免受核酸酶的降解作用以及通过升温相变释放siRNA。作为本专利技术基于温敏阳离子纳米凝胶的siRNA载体的制备方法，其纳米凝胶是由一代代烷氧醚单体与阳离子氨基基元单体沉淀聚合后通过透析而制的。本专利技术与现有技术相比较，具有如下显而易见的实质性特点和显著优点：1.本专利技术采用沉淀聚合制备的纳米凝胶粒径为90-120纳米且具有分散性均一的性能；2.本专利技术采用温度敏感的一代树枝化烷氧醚为超分子主体，利用其灵敏的温敏特性，来构筑一类新型的更简易的温度响应载体；3.本专利技术利用树枝状烷氧醚特殊的拓扑结构成功实现对客体分子siRNA的保护；4.本专利技术纳米凝胶表面由于含有更高的电荷密度，使得其在较低的氨基比例条件下具有更高的吸附和释放效率，并且可以通过以温敏的手段控制siRNA的递送，有望在基因诊断、治疗及药物控释等领域有良好的应用前景。附图说明图1为温度敏感型siRNA纳米凝胶载体的反应示意图；图2为阳离子氨基基元单体的核磁谱图；图3纳米凝胶的AFM图；图4纳米凝胶相变过程的紫外吸收谱图；图5不同时间下的凝胶电泳成像；图625oC下的凝胶电泳成像；图745oC下的凝胶电泳成像。具体实施方式请给出制备温度敏感型siRNA纳米凝胶载体的完整的实施例本专利技术的优选实施例详述如下：1.烷氧醚树枝化结构的阳离子氨基基元单体的制备MG1-NH3+的制备：将MG1-Boc溶于二氯甲烷/三氟乙酸（1:1体积比）中，反应过夜，通过薄层层析法确认反应完全后，用甲醇淬灭反应，蒸干溶剂二氯甲烷，反复加入甲醇溶解并蒸干3次，用二氯甲烷萃取，随后干燥过滤，得到目标化合物MG1-NH3+，核磁结果如图1所示。2.温度敏感型siRNA纳米凝胶载本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种温度敏感型siRNA纳米凝胶载体，其特征在于该载体是由采用氨基封端烷氧醚树枝化基元为氨基基元单体与烷氧醚树枝化单体，通过交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，由引发剂偶氮二异丁脒盐酸盐引发自由基聚合应，形成的具有拓扑结构的温度响应性阳离子纳米凝胶，其中氨基封端烷氧醚树枝化基元和烷氧醚树枝化单体的摩尔比为1:5~1:20，交联剂为单体总摩尔量的4%~6%，引发剂的量为单体总质量的0.4%~0.6%；所述的氨基封端烷氧醚树枝化基元的结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种温度敏感型siRNA纳米凝胶载体，其特征在于该载体是由采用氨基封端烷氧醚树枝化基元为氨基基元单体与烷氧醚树枝化单体，通过交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯，由引发剂偶氮二异丁脒盐酸盐引发自由基聚合应，形成的具有拓扑结构的温度响应性阳离子纳米凝胶，其中氨基封端烷氧醚树枝化基元和烷氧醚树枝化单体的摩尔比为1:5~1:20，交联剂为单体总摩尔量的4%~6%，引发剂的量为单体总质量的0.4%~0.6%；所述的氨基封端烷氧醚树枝化基元的结构式为：或；所述的烷氧醚树枝化单体或其中Y=MeO或X=EtO；X=NH3+。2.一种制备根据权利要求1所述的温度敏感型siRNA纳米凝胶载体的方法，其特征在于该方法的具体合成步骤如下：将含有叔丁氧羰基的树枝化烷氧醚单体MG1-OEt和三氟乙酸按1:50~1:100的质量比溶于二氯甲烷中，常温反应3~4h，结束后，向反...

【专利技术属性】
技术研发人员：张阿方，陶沛，彭宇，姚欥，方文龙，武剑慧，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海,31