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一种高亲和PD-1蛋白突变体制造技术

技术编号:19445151 阅读:37 留言:0更新日期:2018-11-14 16:14
本发明专利技术公开了一种高亲和PD‑1蛋白突变体,通过将野生型PD‑1的四个氨基酸位点突变:M70I、S87W、A129H、K135M;得到具有更高亲和力的PD‑1蛋白突变体,不但可以显著上调T细胞活化和细胞因子分泌,同时还可以降低使用剂量,降低治疗成本。本发明专利技术还提供了该突变体或其制剂在制备治疗、预防、或者缓解肿瘤相关疾病等药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种高亲和PD-1蛋白突变体
本专利技术涉及分子生物领域,尤其涉及一种高亲和PD-1蛋白突变体,蛋白的结构、对应氨基酸、对应基因序列、制备方法及应用。
技术介绍
程序性细胞死亡蛋白(PD-1)是一种具有268个氨基酸的I型膜蛋白,属于CD28家族成员,其基因位于2号染色体上(TheEMBOJournal(1992),vol.11,issue11,p.3887-3895),其中人的PD-1cDNA由如EMBL/GenBankAcc.No.NM_005018所示的碱基序列组成。据报告,PD-1蛋白主要表达于CD4+CD8+的T细胞表面上(InternationalImmunology(1996),vol.18,issue5,p.773-780.,J.Experimentaled.(2000),vol.191,issue5,p.891-898.)。在骨髓细胞中也观察到PD-1的表达,包括由抗原受体刺激活化的T细胞或B淋巴细胞或活化的巨噬细胞表面(InternationalImmunology(1996),vol.18,issue5,p.765-772.)。PD-1是一种免疫抑制性分子,它的两个糖蛋白配体已得到鉴定,即PD-L1和PD-L2,其被证实与PD-1结合后能够传递免疫抑制性信号,下调T细胞活化和细胞因子分泌,促进肿瘤逃避免疫系统的监控与杀伤(Freemanetal.(2000)J.Exp.Med.192:1027-34;Latchmanetal.(2001)Nat.Immunol.2:261-8;Carteretal.(2002)Eur.J.Immunol.32:634-43;Ohigashietal.(2005)Clin.CancerRes.11:2947-53)。阻断PD-1和PD-L1相互作用成为治疗肿瘤的一条有效途径(SharmaandAllison2015)。目前已知的针对PD-1/PD-L1相互作用的抗肿瘤药物为单克隆抗体药物。然后单抗药物具有免疫原性,个体差异性以及适应症有限等先天局限性,因此设计高亲和PD-1突变体来作为体内PD-1/PD-L1通路的竞争性抑制剂对于调控PD-1通路具有好的应用前景,不但可以恢复T细胞活化和提高细胞因子分泌水平,同时还有可能用于分子探针来检测肿瘤生长情况(Maute,Gordonetal.2015,Abdin,Zaheretal.2018)。
技术实现思路
基于
技术介绍
存在的技术问题,本专利技术提出了一种高亲和PD-1蛋白突变体。本专利技术的技术方案如下:一种高亲和PD-1蛋白突变体,其氨基酸序列为以下组中的任意一个;A、如SEQIDNO:1或3或5或7中的任一所示氨基酸序列;B、如SEQIDNO:1或3或5或7中的任一所示氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。一种高亲和PD-1蛋白突变体,其基因序列为以下组中的任意一个;A、如SEQIDNO:2或4或6或8中的任一所示基因序列;B、如SEQIDNO:2或4或6或8中的任一所示基因序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个基因所得功能相同或相似的基因序列。一种高亲和PD-1蛋白突变体,该蛋白质选自野生型PD-1的四个氨基酸位点突变:M70I、S87W、A129H、K135M。以上的PD-1蛋白突变体与真核蛋白hPD-L1-Fc具有更好的高亲和。一种制剂,含有上述的PD-1蛋白突变体。该PD-1蛋白突变体或其制剂在制备治疗、预防、或者缓解肿瘤相关疾病等药物中的用途。本专利技术的方法及组合物对于缓解与上述肿瘤相关的一种或者多种症状同样是有效的。本专利技术的有益之处在于:本专利技术的高亲和PD-1蛋白突变体,通过将野生型PD-1的四个氨基酸位点突变:M70I、S87W、A129H、K135M;得到具有更高亲和力的PD-1蛋白突变体,不但可以显著下调T细胞活化和细胞因子分泌,同时还可以降低使用剂量,降低治疗成本。附图说明图1:pEGFP-N1质粒图谱;酶切位点:Aval,HindIII,ECORI,PstI。图2:质粒pEGFP-N1-hPD-1及其突变体(M70I、S87W、A129H、K135M)在HEK-293T细胞膜上的定位。图3:流式细胞仪检测hPD-1及其突变体(M70I、S87W、A129H、K135M)与hPD-L1Fc蛋白的结合情况;图4:hPD-1及其突变体蛋白(K135M)与hPD-L1Fc蛋白亲和力MST实验结果。具体实施方式实施例1:pEGFP-N1-hPD-1突变体蛋白重组质粒真核载体的构建。将野生型PD-1的四个氨基酸位点突变:M70I、S87W、A129H、K135M,下面详述pEGFP-N1-hPD-1突变体蛋白重组质粒载体的构建。PCR引物设计:依据hPD-1突变体蛋白的基因序列和密码子表,设计上述四种hPD-1突变体真核载体引物,设计引物如下:(1)PCR扩增hPD-1突变体蛋白基因反应体系为:30ngPD-1DNA模板:1μL,10mMdNTPMix:1.5μL,10μM正向引物:0.75μL,10μM反向引物:0.75μL,10×Pfx50buffer:2.5μL,Pfx50DNApolymerase(5U/μL):1μL,ddH2O:17.5μL。反应条件为:95℃3min,94℃30s,55℃30s,68℃10min,16个循环后68℃、10min。(2)跑胶和胶回收PCR产物:制备1%琼脂糖凝胶,在PCR产物中加入5μL6×LoadingBuffer,点样并电泳。设置电泳参数:电压:200V,时间:20min。切胶并进行胶回收。(3)DpnI酶切pEGFP-N1-hPD-1模板,10μL酶切体系:胶回收产物:7.5μL,10×CutSmartbuffer:2μL,DpnI-HF酶:0.5μL。将酶切体系混匀,离心,封口放于37℃培养箱中双酶切4个小时,随后置于4℃冰箱中备用。(4)使用酶切产物转化XL-1Blue感受态细胞,各取100μL分别涂布LBkan平板。次日挑单克隆,摇菌,送金唯智公司测序验证。经验证测序正确,即构建成功了含有hPD-1基因突变体的真核表达载体,分别命名为pEGFP-N1-hPD-1(M70I)、pEGFP-N1-hPD-1(S87W、pEGFP-N1-hPD-1(A129H)、pEGFP-N1-hPD-1(K135M)。实施例2pEGFP-N1-hPD-1突变体蛋白重组质粒真核载体的转染2.1细胞培养(1)复苏HEK-293T细胞:打开水浴锅预热到37℃,将新鲜的DMEM培养基放入水浴锅中预热,其次,从-80℃冰箱中取出HEK-293T细胞,快速放在37℃水浴锅中不停振荡,直到冻存的细胞完全融化,置入离心机中,设置转速:1000rpm,离心时间:5min。放于生物安全柜中吸弃上清,向冻存管中加入新鲜的DMEM培养基,并轻轻吹打将细胞重悬起来,最后将细胞悬液转移到细胞培养皿中,补加10mLDMEM培养基,放于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行细胞培养。(2)细胞传代:当细胞长满后,吸弃旧培养基,缓慢加入10mL的pH7.2的PBS溶液,轻轻吸弃PBS溶液,加入1mL0.25%的胰酶,待1min后,吸弃掉本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种高亲和PD‑1蛋白突变体,其特征在于,其氨基酸序列为以下组中的任意一个;A、如SEQ ID NO:1或3或5或7中的任一所示氨基酸序列;B、如SEQ ID NO:1或3或5或7中的任一所示氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种高亲和PD-1蛋白突变体,其特征在于,其氨基酸序列为以下组中的任意一个;A、如SEQIDNO:1或3或5或7中的任一所示氨基酸序列;B、如SEQIDNO:1或3或5或7中的任一所示氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸所得功能相同或相似的氨基酸序列。2.一种高亲和PD-1蛋白突变体,其特征在于,其基因序列为以下组中的任意一个;A、如SEQIDNO:2或4或6或8中的任一所示基因序列;B、如SEQIDNO:2或4或6或8中的任一所示基因序列中经过取代和/或缺失和...

【专利技术属性】
技术研发人员:杜江峰高艳锋吴亚红赵文珊祁元明
申请(专利权)人:郑州大学
类型:发明
国别省市:河南,41

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