鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架及其制备方法与应用。该方法包括如下步骤：(1)将粉碎后的鱼鳞浸泡到氯化钠溶液中，然后用水清洗干净，得到鱼鳞A；(2)将鱼鳞A浸泡到乙二胺四乙酸溶液中，然后用水清洗干净，得到鱼鳞B；(3)将鱼鳞B浸泡于柠檬酸溶液中，并加入蛋白酶进行提取，得到混合溶液C；(4)将混合溶液C的pH值调整为11～12，然后放置6～8小时，透析，得到鱼鳞胶原蛋白溶液；(5)向鱼鳞胶原蛋白溶液中加入海藻酸钠溶液，混合均匀后进行冷冻干燥，得到鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架。该支架具有良好的细胞贴附性、生物相容性和生物可降解性能，能够有效促进矿化。

【技术实现步骤摘要】
鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架及其制备方法与应用
本专利技术属于生物材料与组织工程
，特别涉及一种鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架及其制备方法与应用。
技术介绍
胶原蛋白具有良好的生物活性，能够有效促进细胞生长，因此在生物医学领域有着广泛的应用，如用于制备组织工程支架等。胶原蛋白通常取自动物体，如表皮及蹄筋等，但是，由于使用陆生动物源胶原蛋白容易造成跨物种病毒感染，有可能导致患者感染口蹄疫、疯牛病等疾病，对人类社会造成危害，因此，欧美、日本等相继出台法规，限制哺乳动物皮骨中的提取物用于食品医药等对人体直接影响的产品中。而鱼鳞来源于海洋生物，较难对人体造成跨物种病毒感染，且鱼鳞含有大量胶原蛋白、来源广、价格低廉，鱼鳞胶原蛋白具有良好的细胞贴附性与生物相容性，可通过促进角质细胞、成纤维细胞增殖，促进PDGF、TGFβmRNA表达及蛋白合成，提高M2型巨噬细胞含量，促进免疫低下小鼠伤口愈合，用于制备胶原蛋白骨组织工程支架，能够有效促进细胞增殖、降低生产成本。我国淡海水渔液资源十分丰富，鱼鳞作为水产加工废弃物，一直尚未得到充分利用，利用鱼鳞制备生物材料具有广阔的开发前景。全国每年骨缺损患者较多，骨损伤己成为影响人们健康和生活的严重社会问题。目前采用的治疗材料大多数还是传统的惰性生物材料或可降解生物材料制备的组织工程支架，存在着生物活性不足或降解性能不理想、治疗效果差等问题，只能用于修复简单临床病症，难以满足日益增长的临床治疗需求。研究与开发具有合理支架结构与生物活性的骨修复功能性生物材料，具有重要意义，也成为目前研究与开发的热点。CN1814781A公开了一种利用内肽酶和端肽酶从鱼鳞中提取无苦胶原肽的方法，包括采用鱼鳞作为主要原料，并利用内肽酶和端肽酶从鱼鳞中提取无苦鱼鳞胶原肽：经将鱼鳞粉碎过80～200目标准筛，按鱼鳞重量加入6～20倍的水搅拌均匀，将得到的混悬液控制温度为35℃～70℃，pH在6～10，按鱼鳞重量的0.5％～5％加入内肽酶酶解3～12小时，并灭酶；将酶解液降温至35～70℃时，按鱼鳞重量的0.1％～3％加入端肽酶酶解6～16小时，并灭酶；然后经过浓缩、干燥、粉碎得到无苦鱼鳞胶原肽粉末。CN104490732A公开了一种抗衰老鱼鳞胶原多肽面膜及其制备方法，含有以下成分：鱼鳞胶原多肽粉1～20重量份、红景天提取物0.5～3重量份、海藻提取物1～2重量份、甘油3～6重量份、橄榄油1～4重量份、珍珠粉1～3重量份、滑石粉10～30重量份、成膜剂10～30重量份、吐温80为1～2重量份、防腐剂0.10～1.2重量份，所得面膜具有滋养皮肤、美容养颜的作用。CN102327646A公开了一种鱼鳞衍生的组织修复结构，包含提供一个生物相容性佳以及生物可分解性的经适当步骤处理过鱼鳞以及其特殊的微孔道结构，且所述的特殊的微孔道结构有利于细胞的贴附与增生。CN104419741A公开了一种以鱼鳞为原料生产纳米级胶原肽精华的制备方法，包含如下步骤：鱼鳞经过超声波辅助酸处理技术脱灰；然后经过除杂、超声波技术结合酶提取技术提取胶原肽；进一步采用膜分离技术纯化胶原肽提取液；然后经过喷雾干燥技术干燥胶原肽溶液；再经过纳米粉碎机超细微粒化技术纳米化胶原肽，获得纳米级胶原肽产品。CN103588873A公开了一种鱼鳞胶原活性肽的制备方法，以鱼鳞明胶和糖类为原料，利用亚临界水设备处理鱼鳞明胶和糖的混合溶液，制备鱼鳞胶原活性肽溶液，再经过滤、浓缩、喷雾干燥得到鱼鳞胶原活性肽粉末。CN103570827A公开了一种促进提取鱼鳞胶原蛋白的方法，具体包括酸法、盐法、酶法和热水抽提法，该专利技术进一步用超声波作用，提高胶原蛋白的得率，缩短了提取时间。CN103992386A公开了一种大黄鱼鱼鳞抗氧化胶原肽及其制备方法，该抗氧化胶原肽的氨基酸序列为Gly-Pro-Thr-Gly-Phe-Pro-Gly。CN103980360A公开了一种鱼鳞胶原蛋白的快速制备方法，按如下步骤进行：将鱼鳞去除杂质，清洗干净，晾干备用；将处理干净的鱼鳞放入耐高温玻璃瓶中，并按比例向瓶内加入乙酸溶液，包扎瓶口后放入压力容器中加压提取一段时间，然后进行过滤处理，滤液经浓缩、干燥后即得鱼鳞胶原蛋白。CN100381528C公开了一种未变性鱼鳞胶原的制备方法，其特点是将鱼鳞用5～15％的NaCl溶液浸泡24～48小时，搅拌，过滤；用0.05～0.2M的NaOH溶液浸泡24～48小时，搅拌，过滤；用15～50L的H202，NaOH调节pH为8～12，浸泡24～36小时，蒸馏水浸洗，过滤；将鱼鳞用绞肉机绞碎，自然晾干；取绞碎鱼鳞100重量份，用0.1～2M的EDTA溶液1000～2000重量份浸泡24～48小时，微波炉输出功率200～400W，工作频率2450MHz，辐射10～20分钟，搅拌，过滤；加入蛋白酶1～5份，用酸调节pH为2～4，在温度为4～6℃浸泡1～3天，用离心机分离，除去滤渣，清液用0.5～5M的NaCl溶液盐析，沉淀经离心分离，用0.05～2M的乙酸溶解；如此反复盐析操作3～5次，再经膜透析处理3次，获得浓度为0.5～1％的未变性鱼鳞胶原溶液。CN101307348B公开了一种从淡水鱼鱼鳞中制备未变性胶原蛋白的方法，具体步骤为：1)将洗净的鱼鳞加入蒸馏水，用电动搅拌器间歇搅拌3～5分钟，蒸馏水洗至表面无色素和脂肪等附着；自然风干或低温干燥后粉碎至40～50目；2)将1)的材料按1∶10～1∶20加入为8～10％柠檬酸、苹果酸溶液，冰水浴微波处理2min，10～20℃脱钙8～24h，过滤，滤液置10℃以下静置5～10h，得柠檬酸钙沉淀；3)向经步骤2)处理后所得的脱钙鱼鳞中按1∶5至1∶20比例加入1％的苹果酸或柠檬酸溶液(含蛋白酶)于0～20℃搅提取2～4次，每次12～48h，离心，取上清，加NaCl至终浓度为0.7～0.90mol/L，盐析过夜，离心，沉淀用0.50mol/L乙酸溶解，重复盐析和溶解操作1次，将沉淀透析，冷冻干燥得本专利技术的产品。CN102965030B公开了一种高凝胶强度鱼鳞明胶的制备方法，它以鱼鳞废弃物中制备的鱼鳞明胶为对象，通过硫酸铵盐析法，制备出高凝胶强度的鱼鳞明胶产品。CN100485043C公开了一种鱼鳞胶原蛋白及其制造方法，包含下列步骤：(a)将鱼鳞原料洗净后加热处理；(b)将加热处理后的鱼鳞原料以机械破碎处理；(C)经步骤(b)细碎后的鱼鳞原料添加蛋白质水解酶，并于温水下进行酶处理；(d)将经步骤(C)酶处理后的水解液离心；(e)取出经步骤(d)离心过后的上层液；及(f)将步骤(e)所得的上层液干燥成粉末。CN103271217B公开了一种罗非鱼鱼皮及鱼鳞提取鱼胶原蛋白粉的生产方法。其特征在于：是一种纯鱼胶原蛋白粉末，是以新鲜罗非鱼鱼皮和鱼鳞为原料，采用酸泡、冻干、生物酶解、过滤和喷雾干燥等工艺提取而成，完整保留了有效成分的生物活性。CN103352066A本专利技术公开了一种鱼鳞、鱼皮胶原活性肽的生产工艺，包括如下步骤：(1)预处理鱼鳞、鱼皮；(2)酸提法和热提法相结合提取胶原多肽，提取产率超过95％；(3)纯化胶原多肽提取液；(4)浓缩胶原多肽溶液；(5)酶法制备胶原活性肽溶液；(6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将粉碎后的鱼鳞放入到氯化钠溶液中，于10～20℃条件下浸泡2～5小时，然后将浸泡后的鱼鳞取出并用水清洗干净，得到处理后的鱼鳞A；(2)将步骤(1)中处理后的鱼鳞A放入到乙二胺四乙酸溶液中，于10～20℃条件下浸泡3～6小时，然后将浸泡后的鱼鳞取出并用水清洗干净，得到处理后的鱼鳞B；(3)将步骤(2)中处理后的鱼鳞B浸泡于柠檬酸溶液中，并加入蛋白酶进行提取，得到混合溶液C；(4)将步骤(3)中得到的混合溶液C的pH值调整为11～12，然后放置6～8小时，再用透析袋进行透析，得到鱼鳞胶原蛋白溶液；(5)向步骤(4)中得到的鱼鳞胶原蛋白溶液中加入海藻酸钠溶液，混合均匀后进行冷冻干燥，得到鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架。

【技术特征摘要】
1.一种鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将粉碎后的鱼鳞放入到氯化钠溶液中，于10～20℃条件下浸泡2～5小时，然后将浸泡后的鱼鳞取出并用水清洗干净，得到处理后的鱼鳞A；(2)将步骤(1)中处理后的鱼鳞A放入到乙二胺四乙酸溶液中，于10～20℃条件下浸泡3～6小时，然后将浸泡后的鱼鳞取出并用水清洗干净，得到处理后的鱼鳞B；(3)将步骤(2)中处理后的鱼鳞B浸泡于柠檬酸溶液中，并加入蛋白酶进行提取，得到混合溶液C；(4)将步骤(3)中得到的混合溶液C的pH值调整为11～12，然后放置6～8小时，再用透析袋进行透析，得到鱼鳞胶原蛋白溶液；(5)向步骤(4)中得到的鱼鳞胶原蛋白溶液中加入海藻酸钠溶液，混合均匀后进行冷冻干燥，得到鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架。2.根据权利要求1所述鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的鱼鳞胶原蛋白溶液的浓度为20～30μg/ml；步骤(5)中所述的海藻酸钠溶液的浓度为质量百分比4％。3.根据权利要求1所述鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的鱼鳞胶原蛋白溶液与海藻酸钠溶液的体积比为1:1～4。4.根据权利要求1所述鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的氯化钠溶液的浓度为0.05～0.5mol/L；步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：敖宁建，林越威，张丽，叶开均，商玉莲，谢浩诗，李洲，李日旺，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44