一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶的制备方法技术

针对干细胞不易在水凝胶表面粘附增殖、生长因子易突释失活、组织工程支架难以持续诱导软骨分化等问题，本发明专利技术以纤维连接蛋白(FN)和转化生长因子‑β3(TGF‑β3)为模板，以丙烯酰胺和海藻酸钠为功能单体，N，N’‑亚甲基双丙烯酰胺和氯化钙为交联剂，制备促进干细胞粘附、增殖和软骨分化的双模板分子印迹聚丙烯酰胺/海藻酸钙/硅酸钙@SiO2高强度水凝胶。通过FN模板构建的印迹孔穴和位点吸附更多的FN促进干细胞粘附和增殖；以TGF‑β3模板构建的印迹孔穴和位点结合TGF‑β3后，实现TGF‑β3的缓释，保护其活性并促进干细胞软骨分化。本发明专利技术得到一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶。

【技术实现步骤摘要】
一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶的制备方法
本专利技术涉及一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶的制备方法，属于生物材料和组织工程领域。
技术介绍
骨关节炎已成为世界上头号致残疾病，但由于软骨中没有血管提供营养，软骨细胞迁徙能力差，关节软骨损伤后无法自行修复。临床上关节软骨损伤目前主要以手术治疗为主，包括骨切开术、关节镜修复术、自体软骨移植术和关节固定术等。这些方法仅能缓解疼痛，不能替代软骨的生物特性，更不能促进软骨再生，长期疗效备受争议。目前关节软骨组织工程修复的研究尚处于实验阶段，仍存在支架材料机械性能差、降解不可控、材料缺乏生物活性、昂贵的生长因子易突释失活、不能持续诱导细胞软骨分化等问题。水凝胶是由高分子三维网络与水组成的多元体系，其与许多组织和细胞外基质非常接近，表现出良好的生物相容性，同时为营养物质运输和代谢废物的排出提供良好通道。水凝胶可作为永久软组织损伤替代物，或作为细胞培养基质材料。Chaudhuri等将含有软骨细胞的水凝胶用于替代损伤软骨【NatureMaterials，2017，16：1243-1251】。常江等制备了可注射的复合水凝胶，该水凝胶可以促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化【ActaBiomaterialia，2013，9(11)：9107-9117】。但是通常的水凝胶强度较低，限制了其在关节软骨修复中的实际应用。高强度水凝胶的研究近年来取得了重要进展。龚剑萍等提出“双层网络”水凝胶的思想，在形成高交联度的刚性第一层网络的凝胶基础上，其内部合成交联度较低的柔性第二层网络【AdvancedMaterials.2014，26：436-442】。这种水凝胶在保持高含水量的同时也具有高的强度。但是该双化学网络交联水凝胶制备过程比较复杂。锁志刚等人用一步法制备了高弹性高韧性聚丙烯酰胺/海藻酸钙(PAM/CaAlg)双网络水凝胶【Nature，2012，489(7414)：133-136】。此水凝胶具有良好的生物相容性、优良的润滑性和耐磨性，可达到替代软骨组织的要求。Bakarich等用3D打印技术制备了纤维增强的PAM/CaAlg水凝胶人工关节软骨替代物【ACSAppliedMaterials&Interfaces，2014，6(18)：15998-16006】。但是在生理环境下，PAM/CaAlg双网络水凝胶中的交联离子被释放出来，使凝胶的力学性能迅速下降。目前，构建在长期生理环境下具备高强度、高韧性和低溶胀的水凝胶仍存在很大挑战。柳明珠等将二氧化硅引入PAM/CaAlg水凝胶中，提高了该双网络凝胶的断裂应力和杨氏模量【ChemicalEngineeringJournal，2014，240(6)：331-337】。Kim等人利用介孔分子筛与聚合物之间存在的范德华力和氢键作用，得到了可在生理溶液中较长时间保持力学性能的PAM/CaAlg杂化水凝胶。Tiller等通过酶引发在双网络水凝胶中形成了均匀分散的纳米磷酸钙，使水凝胶的弹性模量达到了440MPa，远高于软骨【Nature，2017，543(7645)：407-410】。但是由于水凝胶光滑的表面和高的亲水性，细胞在水凝胶表面不易粘附增殖。即使在水凝胶中加入了纤维粘连蛋白促进细胞粘附，也难以控制贴壁细胞的密度。三维培养因细胞包埋过深影响养分和代谢物传输，引起细胞死亡。高强度水凝胶在制备过程中的恶劣环境如反应热、单体毒性、聚合过程中的自由基等对细胞造成巨大损伤。为了减小聚合反应对细胞的损伤，唐睿康教授等采用层层自组装方法，在酵母菌表面包裹一层磷酸钙【AngewandteChemie，2008，47，3560-3564】。赋予高强度水凝胶诱导软骨分化的生物活性，防止“去分化”现象，是实现其软骨替代修复需要解决的另一科学难题。转化生长因子既是软骨分化最重要的启动者，又是软骨分化过程中的重要维持者。但是加入昂贵的转化生长因子存在以下问题：(1)外源性转化生长因子在体内容易失去活性；(2)生长因子易突释。因此，如何识别保护并缓慢释放生长因子是持续诱导软骨分化急需解决的关键问题。分子印迹技术是制备在空间结构和结合位点上与模板分子相匹配，从而对模板分子具有专一识别特性的聚合物(分子印迹聚合物molecularimprintedpolymer，MIP)的技术。相比天然抗体，MIP表现出稳定性高和使用寿命长的特点，可抗恶劣环境，且制备过程简单。Pan等采用分子印迹技术合成了对细胞粘附肽RGDS具有温度响应性识别能力的分子印迹水凝胶，可促进细胞粘附和增殖【Angewandtechemie2013，52(27)：6907-6911】。分子印迹技术构建了与模板相互补的孔穴和结合位点，两者的协同作用可以实现对目标分子的控制释放。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术拟解决的技术问题是干细胞不易在水凝胶表面粘附增殖、生长因子易突释失活、组织工程支架难以持续诱导软骨分化的问题。本专利技术解决所述干细胞不易在水凝胶表面粘附增殖、生长因子易突释失活、组织工程支架难以持续诱导软骨分化的问题的技术方案是提供一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶的制备方法。针对干细胞不易在水凝胶表面粘附增殖、生长因子易突释失活、组织工程支架难以持续诱导软骨分化等问题，本专利技术以纤连蛋白(FN)和转化生长因子-β3(TGF-β3)为模板，以丙烯酰胺和海藻酸钠为功能单体，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺和氯化钙为交联剂，制备促进干细胞粘附、增殖和软骨分化的双模板分子印迹聚丙烯酰胺/海藻酸钙/硅酸钙@SiO2高强度水凝胶。通过FN模板构建的印迹孔穴和位点吸附更多的FN促进干细胞粘附和增殖；以TGF-β3模板构建的印迹孔穴和位点结合TGF-β3后，实现TGF-β3的缓释，保护其活性并促进干细胞软骨分化。本专利技术得到一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶。本专利技术提供了一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶的制备方法，其特征是包括以下步骤：a)称取0.005-2g硅酸钠，5-15g丙烯酰胺，0.5-2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％-0.30％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于50-100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将纤连蛋白和转化生长因子-β3溶解于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A和铸膜液B静置消泡后分别放置于无菌容器中备用；b)配制质量百分比为0.5％-50％的可溶性钙盐水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；c)向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％-2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为10-1000μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为20-2000μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1-20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；d)将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的可溶性钙盐水溶液中，浸泡0.1-24h，可溶性钙盐与海藻酸钠反应生成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶的制备方法，其特征是包括以下步骤：a)称取0.005‑2g硅酸钠，5‑15g丙烯酰胺，0.5‑2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％‑0.30％的N，N′‑亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于50‑100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将纤连蛋白和转化生长因子‑β3溶解于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A和铸膜液B静置消泡后分别放置于无菌容器中备用；b)配制质量百分比为0.5％‑50％的可溶性钙盐水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；c)向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.1％‑5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％‑5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％‑2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为10‑1000μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为20‑2000μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1‑20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；d)将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的可溶性钙盐水溶液中，浸泡0.1‑24h，可溶性钙盐与海藻酸钠反应生成海藻酸钙，可溶性钙盐与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；e)配制质量百分比浓度为0.1％‑10％的葡萄糖酸‑δ‑内酯水溶液，将步骤d)得到的含硅酸钙的凝胶膜浸泡到葡萄糖酸‑δ‑内酯水溶液中0.1‑12h，葡萄糖酸‑δ‑内酯水解释放出氢离子，氢离子与硅酸钙反应，在硅酸钙纳米粒子表面形成介孔硅胶结构，介孔硅胶与海藻酸钙和聚丙烯酰胺发生氢键相互作用，再加上纳米粒子的增强效应，提高了聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶在生理环境下的力学稳定性和抗溶胀性；f)在无菌条件下，将步骤e)得到的水凝胶膜用洗脱溶液洗脱掉纤连蛋白和转化生长因子‑β3，得到纤连蛋白和转化生长因子‑β3双模板分子印迹高强度水凝胶；g)将步骤f)得到的双模板分子印迹高强度水凝胶吸附负载纤连蛋白和转化生长因子‑β3后，得到可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶；通过纤连蛋白构建印迹孔穴和位点吸附更多的纤连蛋白，促进干细胞在水凝胶表面的粘附增殖；通过转化生长因子‑β3构建的印迹孔穴和位点结合更多的转化生长因子‑β3，并实现该生长因子的缓释，保护转化生长因子‑β3的活性并促进干细胞软骨分化。...

【技术特征摘要】
1.一种可诱导干细胞软骨分化的双模板分子印迹高强度水凝胶的制备方法，其特征是包括以下步骤：a)称取0.005-2g硅酸钠，5-15g丙烯酰胺，0.5-2g海藻酸钠，丙烯酰胺质量百分比0.03％-0.30％的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺，一起溶于50-100ml去离子水中，搅拌溶解均匀，得到铸膜液A，然后将纤连蛋白和转化生长因子-β3溶解于铸膜液A中得到铸膜液B，将铸膜液A和铸膜液B静置消泡后分别放置于无菌容器中备用；b)配制质量百分比为0.5％-50％的可溶性钙盐水溶液，灭菌消毒，置于无菌容器中备用；c)向步骤a)制备的铸膜液A和铸膜液B中分别加入丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的过硫酸铵，丙烯酰胺质量百分比0.1％-5％的亚硫酸氢钠和丙烯酰胺质量百分比0.01％-2％的四甲基乙二胺，搅拌分散均匀后，立即将铸膜液A倒入干燥清洁的玻璃板上，用厚度为10-1000μm的刮膜棒刮成厚度均匀的液膜，然后尽快在该液膜上面倒入铸膜液B，马上用厚度为20-2000μm的刮膜棒刮平；在N2保护下紫外照射1-20min引发丙烯酰胺聚合，得到化学交联的凝胶膜；d)将步骤c)得到的化学交联的凝胶膜和玻璃板一起浸泡到步骤b)得到的可溶性钙盐水溶液中，浸泡0.1-24h，可溶性钙盐与海藻酸钠反应生成海藻酸钙，可溶性钙盐与硅酸钠反应在聚丙烯酰胺/海藻酸钙水凝胶中原位生成硅酸钙纳米粒子；e)配制质量百分比浓度为0.1％-10％的葡萄糖酸-δ-内...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵孔银，王力鑫，张天烨，许国庆，李淑文，李天泽，夏伦，朱敦皖，魏俊富，
申请(专利权)人：天津工业大学，
类型：发明
国别省市：天津,12