基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法技术

本发明专利技术属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法。该方法包括：a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au‑S1/S2；b)铅离子依赖性DNA酶的酶切辅助；c)电化学生物传感器的构建：向步骤b)得到的反应物中加入亚甲蓝MB，孵育反应得到样品，将样品通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定MB的DPV信号，建立标准曲线；d)样品检测：将凝血酶样品，按上述方法检测，测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中的凝血酶浓度。本发明专利技术能够快速、高灵敏高选择性的检测凝血酶，克服了现有检测方法灵敏度低，检测耗时，成本过高以及步骤繁琐的缺点。

【技术实现步骤摘要】
基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法
本专利技术属于分析检测
，更具体地，涉及一种基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法。
技术介绍
凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，由凝血酶原在Xa因子作用下转化而来，将纤维蛋白原转换为纤维蛋白，在凝血级联机制中有着重要的作用。研究表明，凝血酶与很多疾病如血栓栓塞性疾病、中枢神经性疾病、肾病等有着密切的关系，其浓度的改变会导致功能的转变。例如，在肾组织中，低浓度的凝血酶有细胞保护作用，而高浓度的凝血酶会引起肾脏损伤。因此，定量检测复杂生物样品中的凝血酶含量对临床研究和早期诊断有重要的意义。目前已经建立了基于适配体的比色法、荧光法、电化学发光法、电化学方法，极大地提高其选择性，其中电化学方法由于具有检测迅速、设备简单便携的优点引起关注。但是这些电化学方法大多需要进行复杂的电极修饰，对实验条件、环境要求严格，技术上限制了广泛应用。因此，需要设计一个简单、准确、灵敏的电化学方法用于凝血酶的检测。磁性Fe3O4@Au纳米材料的磁性特征满足在实验过程简单快速的磁性分离，避免耗时较长的超滤离心操作，而且在测定时通过磁控诱导在电极表面成膜，利用磁性纳米材料吸附固定在磁性玻碳电极表面，而且去除磁芯后可使磁性材料自行脱落，省去了漫长的抛光打磨电极的过程，具有自清洁的特点。另外，它具有较大的比表面积，可以通过表面修饰与DNA材料结合得到生物纳米材料。DNA分子除了具有基因的遗传特性外，同时也是一个结构精巧的一维纳米线，包括适配体、DNA酶、适配体和DNA酶复合物Aptazyme。由于DNA序列设计灵活、合成方法成熟、价格适宜的优势，成为目前研究的热门材料。其中，适配体特异性识别目标物，提高选择性，拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，稳定性好，可以作为抗体的替代物。金属离子依赖性DNA酶是一段特定的单链DNA序列，在二价金属离子辅助下具有切割底物酶活性，和底链互补后在特定的位点将底链分解成两部分。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法，能够快速、高灵敏高选择性的检测凝血酶，克服了现有检测方法灵敏度低，检测耗时，成本过高以及步骤繁琐的缺点。为了实现上述目的，本专利技术提供一种基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法，包括如下步骤：a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au-S1/S2：将修饰有引物链S1的磁性Fe3O4@Au纳米粒与凝血酶适配体S2共孵育；b)铅离子依赖性DNA酶的酶切辅助：向步骤a)构建的复合材料中加入不同浓度的凝血酶，在铅离子依赖性DNA酶S3和铅离子的辅助下共孵育；c)电化学生物传感器的构建：向步骤b)得到的反应物中加入亚甲蓝MB，孵育反应得到样品，将样品通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定MB的DPV信号，建立标准曲线；d)样品检测：将未知浓度的凝血酶样品，按上述方法检测，测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中的凝血酶浓度；其中，S1为核酸序列，其序列中包含铅离子依赖性DNA酶S3的底物序列以及凝血酶适配体S2的互补配对序列，并且，这两部分存在重叠，从而使得S1与S2互补结合时，S3无法酶切S1上的rA位点。本专利技术使用了铅离子依赖性DNA酶，在Pb2+存在时，该DNA酶能够在底物链的腺嘌呤核糖核苷酸rA位点切割底物链。本专利技术方法的检测机理为：磁性Fe3O4@Au为载体固定互补链S1，S1内含凝血酶适配体互补序列，与凝血酶适配体S2互补杂交形成双链(Fe3O4@Au-S1/S2)，亚甲蓝(MB)作为电化学信号分子能够吸附到DNA上，大量MB可以吸附在双链上。如果加入目标物凝血酶，凝血酶与S2特异性结合，S1/S2互补结构打开，S1完全暴露(Fe3O4@Au-S1)，那么吸附的MB减少，电信号降低。铅离子依赖性DNA酶和铅离子的加入，在S1的rA位点发生特异性的酶切，DNA上可吸附的MB进一步减少，电信号下降的更多。反应结束后，复合材料通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定MB的DPV信号。MB电化学信号的高低与体系中凝血酶的浓度相关，实现电化学传感检测凝血酶。根据本专利技术，本领域技术人员可以根据上述原理设计S1的序列，根据本专利技术一种优选实施方式，S1中铅离子依赖性DNA酶S3的底物序列为18-22个碱基，凝血酶适配体S2的互补配对序列为12-16个碱基。具体优选地，如表1所示，S1具有SEQIDNO：1所示序列，S2具有SEQIDNO：2所示序列，S3具有SEQIDNO：3所示序列。表1注：rA为腺嘌呤核糖核苷酸本专利技术中，Fe3O4@Au作为载体的同时便于磁性分离和电极的磁性诱导吸附，S2作为识别元件，S3的引入提高反应体系的灵敏度，MB作为信号分子，通过MB电化学信号的高低反映凝血酶的含量，实现对目标物的定量检测。根据本专利技术，步骤a)中，Fe3O4@Au-S1通常由Fe3O4与HAuCl4制得，制备时Fe3O4与HAuCl4质量比优选为1:3～1:7。本专利技术中Fe3O4@Au的制备方法可为本领域公知的方法，具体操作如下：溶剂热法制备Fe3O4，取4.7215gFeCl3.6H2O，80mL水于250mL三颈瓶中，超声溶解，800rmpmin-1搅拌，待温度达到80℃时，加入1.7256gFeCl2.4H2O，通N2除氧，逐滴加入氨水10mL。继续反应30min后，停止加热，冷却水洗至中性，分散于无水甲醇中。取适当的100mgFe3O4纳米粒，加入2mLof10％(v/v)APTES无水乙醇溶液搅拌12h，得到APTES修饰的Fe3O4(Fe3O4-APTES)，磁性分离，用乙醇清洗，并分散在无水乙醇中。随后，取0.8mg制备好的Fe3O4-APTES、0.24μL1％的HAuCl4以及10mL的蒸馏水超声混合，然后逐滴加入0.5mL25mmolL-1NaBH4直至颜色由棕黄色变成紫红色。根据本专利技术，体系中S1、S2和S3的浓度优选均为50-200μM。步骤a)中，S1与S2的浓度比优选为1:0.8-1.2，通常为1:1；加入S2孵育的时间优选为10～50min，温度优选为35-40℃，最优选为37℃；步骤b)中，孵育的时间优选为10～50min，温度优选为35-40℃，最优选为37℃。根据本专利技术，步骤b)中，凝血酶的浓度范围优选为0～5nM；根据本专利技术一种具体实施方式，多个凝血酶的浓度依次为5pM，10pM，25pM，50pM，100pM，500pM，1000pM，5000pM。根据本专利技术，步骤c)中，测定MB的电压可根据需要确定，优选为-0.6～0.2V。本专利技术与现有技术相比，具有如下显著优点：1、本专利技术无需进行复杂的电极修饰，利用磁性诱导将待测的复合纳米材料吸附到磁性玻碳电极表面，测定过程简单方便。2、本专利技术中不仅引入铅离子依赖性DNA酶，极大地提高了体系的灵敏度，而且引入凝血酶适配体，提高了体系选择性，实现凝血酶的高选择性高灵敏度检测。3、基于本专利技术的传感策略，仪器设备简单便携，操作简单、快速，有利于专利技术的推广应用。本专利技术的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au‑S1/S2：将修饰有引物链S1的磁性Fe3O4@Au纳米粒与凝血酶适配体S2共孵育；b)铅离子依赖性DNA酶的酶切辅助：向步骤a)构建的复合材料中加入不同浓度的凝血酶，在铅离子依赖性DNA酶S3和铅离子的辅助下共孵育；c)电化学生物传感器的构建：向步骤b)得到的反应物中加入亚甲蓝MB，孵育反应得到样品，将样品通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定MB的DPV信号，建立标准曲线；d)样品检测：将未知浓度的凝血酶样品，按上述方法检测，测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中的凝血酶浓度；其中，S1为核酸序列，其序列中包含铅离子依赖性DNA酶S3的底物序列以及凝血酶适配体S2的互补配对序列，并且，这两部分存在重叠，从而使得S1与S2互补结合时，S3无法酶切S1上的rA位点。

【技术特征摘要】
1.一种基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au-S1/S2：将修饰有引物链S1的磁性Fe3O4@Au纳米粒与凝血酶适配体S2共孵育；b)铅离子依赖性DNA酶的酶切辅助：向步骤a)构建的复合材料中加入不同浓度的凝血酶，在铅离子依赖性DNA酶S3和铅离子的辅助下共孵育；c)电化学生物传感器的构建：向步骤b)得到的反应物中加入亚甲蓝MB，孵育反应得到样品，将样品通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定MB的DPV信号，建立标准曲线；d)样品检测：将未知浓度的凝血酶样品，按上述方法检测，测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中的凝血酶浓度；其中，S1为核酸序列，其序列中包含铅离子依赖性DNA酶S3的底物序列以及凝血酶适配体S2的互补配对序列，并且，这两部分存在重叠，从而使得S1与S2互补结合时，S3无法酶切S1上的rA位点。2.根据权利要求1所述的基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法，其中，S1中铅离子依赖性DNA酶S3的底物序列为18-22个碱基，凝血酶适配体...

【专利技术属性】
技术研发人员：周学敏，朱春红，朱婉莹，徐磊，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32