本发明专利技术涉及一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用，属于新型纳米功能材料、免疫分析和生物传感器领域。其制备三维多孔二硫化钼负载金纳米粒子h‑MoS2/Au NPs作为基底材料修饰裸玻碳电极，提高肿瘤标志物捕获抗体的固载量，并有效加速电极表面的电子传递速率；制备正八面体氧化亚铜/二氧化钛核壳结构负载介孔铂铜纳米粒子Cu2O@TiO2/PtCu复合纳米材料固载检测抗体，并利用其对双氧水H2O2的优异电化学催化性能制得了简单、快速、灵敏的夹心型电化学免疫传感器，用于胃癌相关肿瘤标志物的检测。
【技术实现步骤摘要】
一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用
本专利技术属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感
，具体涉及一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法及应用。
技术介绍
胃癌已是我国常见的恶性肿瘤之一，中国每年新增胃癌病例为40.5万人，占世界新增病例的42.5%，发病率居消化系统肿瘤之首；专家介绍到：胃癌是可防可治的，只要早期发现、早期治疗，治愈率可达90%；因此早期诊断对胃癌的预防和治疗具有重要的临床意义。CA72-4是目前诊断胃癌的最佳肿瘤标志物之一，对胃癌具有较高的特异性，其敏感性可达28-80%，对胃癌的早期诊断具有重要意义。目前，对于肿瘤标志物的检测方法很多，如放射免疫分析法、免疫放射分析法、化学免疫发光分析法、时间分辨荧光免疫分析法等，但多数检测方法繁琐，操作复杂，费用昂贵，检出限高，因此，建立一种快速、简便、灵敏的检测方法有重要意义。夹心型电化学免疫传感器将高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术相结合，具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点，在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。而构建电化学免疫传感器的关键有两点：其一是采用简单、快速、有效的方法将抗原抗体等生物分子固定在电极表面；其二是开发传感器的信号放大技术。三维多孔二硫化钼/金纳米粒子复合材料(h-MoS2/AuNPs)具有大的比表面积和良好的生物相容性，可以显著提高捕获抗体Ab1的固载量，并有效加速电极界面的电子传递速度；新颖复合纳米材料Cu2O@TiO2/PtCu利用各组分协同作用对H2O2的良好电催化作用，实现多重信号放大，实现对胃癌肿瘤标志物的灵敏检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备简单、灵敏度高、特异性强、检测快速的可用于胃癌相关肿瘤标志物检测的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，所制备的传感器可用于胃癌肿瘤标志物的快速、灵敏检测等应用。基于此目的，本专利技术先采用一锅法制备出多孔二硫化钼/金纳米粒子复合材料h-MoS2/AuNPs对裸玻碳电极进行修饰，有效提高了电极的有效比表面积，增大了抗体的负载量；并且极大增强了电极界面的电子响应速度和对测试底液的电催化信号强度等性能；然后利用Cu2O@TiO2/PtCu固定胃癌肿瘤标志物检测抗体；进而通过Cu2O@TiO2/PtCu对H2O2的良好电催化作用以及良好的生物相容性用于固载检测抗体，构建夹心型免疫传感器，实现对胃癌肿瘤标志物的灵敏检测。本专利技术的技术方案如下：1.一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：(1)制备h-MoS2/AuNPs取20～24mg的(NH4)2MoS4和2mL、质量分数为1%的HAuCl4·4H2O混合溶解在20mL的超纯水中，超声10min；随后，加入100µL的水合肼溶液，超声30min，使混合液均匀分散；将混合液转移到50mL的聚四氟乙烯反应釜中，加热至180～220℃，反应8～12h；冷却至室温，超纯水和乙醇依次离心洗涤2～4次；产物再次溶解在3mL超纯水中，冻干机干燥，制得h-MoS2/AuNPs；(2)制备Cu2O@TiO2/PtCu-Ab2检测抗体孵化物溶液将8~12mL、2.0mol/L的NaOH溶液逐滴加入到含3.33g聚乙烯吡咯烷酮的100mL、0.01mol/L的CuCl2溶液中，充分搅拌0.5h；继续将8~12mL、0.6mol/L的抗坏血酸溶液逐滴加入到上述混合液中，55℃下充分搅拌2~4h；离心分离，所得沉淀用超纯水和无水乙醇依次洗涤三次；室温下真空干燥12h，制得Cu2O正八面体；取23~27mg的Cu2O正八面体溶解于65mL的超纯水中，超声10min，分散均匀；将0.9~1.1mL、0.02mol/L的TiF4水溶液缓慢逐滴加入到Cu2O悬浮液中，充分搅拌1h，使混合液均匀分散；将混合液转移到100mL的聚四氟乙烯反应釜中，加热至160～200℃，反应0.5h；冷却至室温，超纯水和乙醇依次离心洗涤2～4次；60℃真空干燥，制得Cu2O@TiO2正八面体纳米晶体；将80~120mg的Cu2O@TiO2加入到8~12mL的无水乙醇中，加入0.1~0.2mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5~2.5h，离心分离，超纯水洗涤，80℃干燥12h，得到Cu2O@TiO2-NH2；取0.3~0.5g精氨酸和1.0~1.2g聚乙烯吡咯烷酮溶解在45mL的超纯水中，超声10min，分散均匀；磁力搅拌下，将3.5~4.0mL、0.05mol/L的H2PtCl64H2O和1.0~1.5mL、0.05mol/L的CuCl2溶液混合加入到上述混合溶液中，超声20分钟，使混合液均匀分散；将混合液转移到聚四氟乙烯反应釜中，加热至180～220℃，反应1.5～2.5h；冷却至室温，得到介孔PtCu合金纳米粒子溶液；将8~12mg的Cu2O@TiO2-NH2加入到30mL的介孔PtCu合金纳米粒子溶液中，振荡12h，离心洗涤，制得Cu2O@TiO2/PtCu；配置3mL、2.5~3.5mg/mL的Cu2O@TiO2/PtCu检测抗体标记物溶液，加入3mL、100µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12h；离心分离后，加入3mL、pH=7.17磷酸盐缓冲溶液，得到Cu2O@TiO2/PtCu-Ab2检测抗体孵化物溶液，4℃下保存备用；(3)制备夹心型电化学免疫传感器1)将直径为4mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；2)将6µL、1.0~3.0mg/mL的h-MoS2/AuNPs溶液滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；3)继续将6µL、8~12µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液滴涂到电极表面，4℃晾干；4)继续滴加3µL、质量分数为0.1~1.0%的牛血清白蛋白BSA溶液到修饰电极表面，以封闭电极表面上未结合Ab1的非特异性活性位点，用pH为7.17的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干；5)超纯水冲洗掉未结合的BSA后，继续滴加6µL、10fg/mL~200ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，4℃晾干，超纯水冲洗；6)将6µL、2.0~4.0mg/mL的肿瘤标志物检测抗体孵化物Cu2O@TiO2/PtCu-Ab2溶液滴涂到电极表面，室温下孵化30~60min，用pH为7.17的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4℃晾干，制得一种检测胃癌肿瘤标志物的夹心型免疫传感器。2.所述的夹心型免疫传感器用于胃癌相关肿瘤标志物的检测：(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，修饰完全的玻碳电极为工作电极，在10mL、50mmol/L的pH5.29~8.04磷酸盐缓冲溶液中进行测试；(2)用计时电流法对胃癌肿瘤标志物进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔0.1s，运行时间300s；(3)当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10mL、50mmol/L的pH=7.17磷酸盐缓冲溶液中注入10μL、5mol/L的双氧水溶液，记录电流变化；(4)用血清样品溶液代替胃癌肿瘤标志物抗原标准溶液，按照工作曲线绘制的方法进行检测。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：(1) 制备h‑MoS2/Au NPs取20～24mg的(NH4)2MoS4和2mL、质量分数为1% 的HAuCl4·4H2O混合溶解在20mL的超纯水中，超声10min；随后，加入100 µL的水合肼溶液，超声30min，使混合液均匀分散；将混合液转移到50mL的聚四氟乙烯反应釜中，加热至180～220℃，反应8～12h；冷却至室温，超纯水和乙醇依次离心洗涤2～4次；产物再次溶解在3mL超纯水中，冻干机干燥，制得h‑MoS2/Au NPs；(2) 制备Cu2O@TiO2/PtCu‑Ab2检测抗体孵化物溶液将8 ~ 12 mL、2.0 mol/L的NaOH溶液逐滴加入到含3.33g聚乙烯吡咯烷酮的100mL、0.01 mol/L的CuCl2溶液中，充分搅拌0.5h；继续将8 ~ 12 mL、0.6 mol/L的抗坏血酸溶液逐滴加入到上述混合液中，55℃下充分搅拌2 ~ 4 h；离心分离，所得沉淀用超纯水和无水乙醇依次洗涤三次；室温下真空干燥12 h，制得Cu2O正八面体；取23~27 mg的Cu2O正八面体溶解于65mL的超纯水中，超声10min，分散均匀；将0.9~1.1 mL、0.02 mol/L的TiF4水溶液缓慢逐滴加入到Cu2O悬浮液中，充分搅拌1h，使混合液均匀分散；将混合液转移到100mL的聚四氟乙烯反应釜中，加热至160～200℃，反应0.5h；冷却至室温，超纯水和乙醇依次离心洗涤2～4次；60 ℃真空干燥，制得Cu2O@TiO2正八面体纳米晶体；将80 ~120 mg的Cu2O@TiO2加入到8 ~ 12 mL的无水乙醇中，加入0.1~ 0.2 mL的3‑氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5 ~ 2.5 h，离心分离，超纯水洗涤，80℃干燥12h，得到Cu2O@TiO2‑NH2；取0.3~0.5g精氨酸和1.0~1.2g聚乙烯吡咯烷酮溶解在45 mL的超纯水中，超声10min，分散均匀；磁力搅拌下，将3.5 ~ 4.0mL、0.05 mol/L的H2PtCl6 4H2O和1.0~1.5mL、0.05 mol/L的CuCl2溶液混合加入到上述混合溶液中，超声20分钟，使混合液均匀分散；将混合液转移到聚四氟乙烯反应釜中，加热至180～220℃，反应1.5～2.5 h；冷却至室温，得到介孔PtCu合金纳米粒子溶液；将8 ~ 12 mg 的Cu2O@TiO2‑NH2加入到30mL的介孔PtCu合金纳米粒子溶液中，振荡12 h，离心洗涤，制得Cu2O@TiO2/PtCu；配置3 mL、2.5 ~ 3.5 mg/mL的Cu2O@TiO2/PtCu检测抗体标记物溶液，加入3 mL、100 µg/mL的肿瘤标志物检测抗体Ab2溶液，4℃恒温振荡培养箱中振荡孵化12 h；离心分离后，加入3 mL、pH=7.17磷酸盐缓冲溶液，得到Cu2O@TiO2/PtCu‑Ab2检测抗体孵化物溶液，4℃下保存备用；(3) 制备夹心型电化学免疫传感器1) 将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；2) 将6 µL、1.0~3.0 mg/mL的h‑MoS2/Au NPs溶液滴涂在电极表面，晾干，用超纯水冲洗，晾干；3) 继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1溶液滴涂到电极表面，4℃晾干；4) 继续滴加3 µL、质量分数为0.1~1.0 %的牛血清白蛋白BSA溶液到修饰电极表面，以封闭电极表面上未结合Ab1的非特异性活性位点，用pH为7.17的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4ºC晾干；5) 超纯水冲洗掉未结合的BSA后，继续滴加6 µL、10 fg/mL~200 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液到电极表面，4 ℃晾干，超纯水冲洗；6) 将6 µL、2.0~4.0 mg/mL的肿瘤标志物检测抗体孵化物Cu2O@TiO2/PtCu‑Ab2溶液滴涂到电极表面，室温下孵化30~60 min，用pH为7.17的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，4℃晾干，制得一种检测胃癌肿瘤标志物的夹心型免疫传感器。...
【技术特征摘要】
1.一种检测胃癌肿瘤标志物夹心型免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：(1)制备h-MoS2/AuNPs取20～24mg的(NH4)2MoS4和2mL、质量分数为1%的HAuCl4·4H2O混合溶解在20mL的超纯水中，超声10min；随后，加入100µL的水合肼溶液，超声30min，使混合液均匀分散；将混合液转移到50mL的聚四氟乙烯反应釜中，加热至180～220℃，反应8～12h；冷却至室温，超纯水和乙醇依次离心洗涤2～4次；产物再次溶解在3mL超纯水中，冻干机干燥，制得h-MoS2/AuNPs；(2)制备Cu2O@TiO2/PtCu-Ab2检测抗体孵化物溶液将8~12mL、2.0mol/L的NaOH溶液逐滴加入到含3.33g聚乙烯吡咯烷酮的100mL、0.01mol/L的CuCl2溶液中，充分搅拌0.5h；继续将8~12mL、0.6mol/L的抗坏血酸溶液逐滴加入到上述混合液中，55℃下充分搅拌2~4h；离心分离，所得沉淀用超纯水和无水乙醇依次洗涤三次；室温下真空干燥12h，制得Cu2O正八面体；取23~27mg的Cu2O正八面体溶解于65mL的超纯水中，超声10min，分散均匀；将0.9~1.1mL、0.02mol/L的TiF4水溶液缓慢逐滴加入到Cu2O悬浮液中，充分搅拌1h，使混合液均匀分散；将混合液转移到100mL的聚四氟乙烯反应釜中，加热至160～200℃，反应0.5h；冷却至室温，超纯水和乙醇依次离心洗涤2～4次；60℃真空干燥，制得Cu2O@TiO2正八面体纳米晶体；将80~120mg的Cu2O@TiO2加入到8~12mL的无水乙醇中，加入0.1~0.2mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5~2.5h，离心分离，超纯水洗涤，80℃干燥12h，得到Cu2O@TiO2-NH2；取0.3~0.5g精氨酸和1.0~1.2g聚乙烯吡咯烷酮溶解在45mL的超纯水中，超声10min，分散均匀；磁力搅拌下，将3.5~4.0mL、0.05mol/L的H2PtCl64H2O和1.0~1.5mL、0.05mol/L的CuCl2溶液混合加入到上述混合溶液中，超声20分钟，使混合液均匀分散；将混合液转移到聚四氟乙烯反应釜中，加热至180～220℃，反应1.5～2.5h；冷却至室温，得到介孔PtCu合金纳米粒子溶液；将8~12mg的Cu2O@TiO2-NH2加入到30mL的介孔PtCu合金纳米粒子溶液中，振荡12h，离心洗涤，制得Cu2O@TiO2/PtCu；配置3mL、2.5~3.5mg/mL的Cu2O@TiO2/PtCu检测抗体标记物溶液，加入3m...
【专利技术属性】
技术研发人员：李法瀛，魏琴，冯金慧，曹伟，范大伟，吴丹，庞雪辉，马洪敏，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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