用于表征包含花生抗原的组合物的方法技术

提供了用于测定样品中花生过敏原的体外释放谱的方法。提供了用于测定样品中花生过敏原的一种或多种特征的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表征包含花生抗原的组合物的方法相关申请本申请要求2015年12月29日提交的美国临时申请号62/272,094和2016年12月8日提交的法国专利申请号163306642.6的权益，将其各自通过题述以其整体并入本文。专利
本专利技术涉及用于表征例如测定包含花生过敏原的治疗性组合物的释放谱、过敏原特征等的方法，所述治疗性组合物用于治疗、缓解或以其他方式降低受试者中的花生过敏。
技术介绍
花生过敏在身体的免疫系统响应于一种或多种花生过敏原产生异常超敏反应时形成。花生过敏在儿童和成人中都是最常见的食物过敏之一。其受到特别的关注，因为其相对常见、通常伴随一生并且能够引起严重的过敏反应。花生过敏是因食物过敏引起过敏性反应(anaphylaxis)和死亡的主要原因。花生是一种常见的食物成分，这使得严格避免很困难。因此，对于那些尝试避免花生的人误食花生的比率相对较高。出于这些原因，花生过敏已经成为重要的公共卫生问题。当前进行的研究着眼于开发用于治疗花生过敏的组合物。需要体外测定已知的和新开发的组合物的花生过敏原释放数据的方法，用于质量控制和预测体内释放谱这两方面。
技术实现思路
本专利技术部分基于发现了测定过敏原的释放谱和/或测定包含过敏原的组合物的致敏特征的高度灵敏的方法。本专利技术描述的方法提供了获得样品中存在的花生过敏原概貌并且允许测量样品中存在的低水平、相关过敏原所需的灵敏度和准确性，所述样品如蛋白质提取物、治疗性组合物或溶出或释放介质。在示例性实施方案中，所述方法包括检测样品中以一种或多种过敏原的一种或多种同种型形式存在的过敏原消化产物。以花生过敏原的多种同种型形式存在的过敏原消化产物的鉴定提供了关于样品的定性和定量信息，其可以作为批次间一致性的指示，并且能够提供储存在基质上或基质中的过敏原的释放谱，所述基质如纳米颗粒。一方面，本专利技术的特征在于一种用于确定组合物中花生过敏原的特征(signature)的高度灵敏的方法。该方法包括从组合物(例如，介质或其他样品)中消化组合物中存在的花生过敏原以产生过敏原消化产物，将过敏原消化产物片段化以产生肽片段，通过质谱法检测和鉴定过敏原消化产物，和确定组合物中花生过敏原的特征的步骤。在特定实施方案中，所述方法用于确定组合物中以低浓度存在的一种或多种花生过敏原的特征。所述特征包括组合物中过敏原的类型和量(例如，相对量)。在某些实施方案中，组合物是水性介质，例如水性药物组合物，分析样品，溶出介质或释放介质。在一些实施方案中，组合物中花生过敏原的总量非常低。例如，特定花生过敏原(例如，Arah1、Arah2、Arah3或Arah6)的量可低于约2μg/ml、低于约1.5μg/ml、低于约1μg/ml或低于约0.5μg/ml、例如约0.2μg/ml。在一些实施方案中，该方法还包括将花生过敏原特征与特征标准进行比较的步骤。特征标准可以是由监管机构例如FDA(食品和药品管理局)或EMA(欧洲药品协会)设定的肽谱，根据工业标准建立的肽谱，或通过重复实验确定的根据预期设定的谱。特征标准可以详细说明(specify)预期在样品中发现的花生过敏原的类型和相对量。在某些示例性实施方案中，过敏原消化产物的长度为约4个氨基酸至约50个氨基酸，长度为约6个氨基酸至约30个氨基酸，或者长度为约15个氨基酸至约20个氨基酸，或长度为约15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些示例性实施方案中，通过包括串联质谱的方法进行对过敏原消化产物的片段化和检测肽片段的步骤，所述串联质谱例如液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)、纳米串联质谱(nanoLC-MS-MS)或纳米高效液相色谱-串联质谱(nanoHPLC-MS-MS)。在某些示例性实施方案中，所述特征(例如，花生过敏原特征和/或特征标准)包含一种或多种Arah1过敏原消化产物，其具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO:17、SEQIDNO:70、SEQIDNO:177、SEQIDNO:155、SEQIDNO:93和SEQIDNO:40。在一些实施方案中，所述特征包含来自Arah1、Arah2和Arah6的过敏原消化产物。在其他实施方案中，标记包括来自Arah1、Arah2、Arah3和Arah6的过敏原消化产物。在一些实施方案中，所述特征包括一种或多种过敏原消化产物，所述过敏原消化产物具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO:17、SEQIDNO:70、SEQIDNO:177、SEQIDNO:197、SEQIDNO:198、SEQIDNO:199、SEQIDNO:200、SEQIDNO:201、SEQIDNO:236和SEQIDNO:237。在一些实施方案中，所述特征包括一种或多种过敏原消化产物，所述过敏原消化产物具有选自下组的氨基酸序列：SEQIDNO:17、SEQIDNO:70、SEQIDNO:197、SEQIDNO:198、SEQIDNO:199、SEQIDNO:200、SEQIDNO:201、SEQIDNO:236和SEQIDNO:237。在一些实施方案中，适用于建立花生过敏原谱的过敏原消化产物存在于花生过敏原超过一种的同种型中，例如特定过敏原(例如，Arah蛋白或多肽)的2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或更多种同种型。例如，适用于花生过敏原特征谱的过敏原消化产物可以存在于如下之一或任何组合中：Arah1的2、3、4、5、6、7、8或更多种同种型，Arah2的2、3、4、5、6、7、8或更多种同种型，Arah3的2、3、4、5、6、7、8或更多种同种型，和/或Arah6的2、3、4、5、6、7、8或更多种同种型。在一些实施方案中，适用于花生过敏原特征谱的过敏原消化产物存在于一种或多种花生过敏原的所有同种型中。在某些示例性实施方案中，将花生过敏原用一种或多种蛋白酶消化。例如，将花生过敏原可以用一种或多种选自胰蛋白酶、内蛋白酶Lys-C和内蛋白酶Arg-C的蛋白酶消化。在某些示例性实施方案中，包含花生过敏原的组合物还包含内标(internalstandard)。例如，在一些实施方案中，内标包含一种或多种重同位素，例如13C和/或15N。在某些实施方案中，内标不是全长过敏原，而是肽的片段。该片段通常长度小于50个氨基酸(比如，例如，长度为约4至约50个氨基酸，长度为约6至约30个氨基酸，或者长度为约10至约20个氨基酸)。在一些实施方案中，该片段具有预期或预测的过敏原消化产物的序列。在一个实施方案中，内标由多种花生过敏原肽组成，每种花生过敏原肽在C-末端用重同位素标记。例如，示例性内标可包括Arah1肽的两种或更多种同位素标记的片段、Arah2肽的两种或更多种同位素标记的片段、Arah3肽的两种或更多种同位素标记的片段和Arah6肽的两种或更多种同位素标记的片段的任何组合。在一个实施方案中，用胰蛋白酶消化包含花生抗原的组合物，将包含13C和/或15N标记的花生过敏原肽的标准混合物加入到消化的混合物中，然后通过片段化测定组合物，例如，通过质谱法，比如例如LC-MS或LC-MS-MS。在某些示例性实施方案中，特征包括不含遗漏的蛋白水解切割位点的过敏原消化产物。另一方面，本专利技术的特征在于一种用于确定包含一种或多种花生过敏原的组合物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于测定水性介质中花生过敏原的特征的方法，包括：消化水性介质中存在的花生过敏原以产生过敏原消化产物；将过敏原消化产物片段化以产生肽片段，和测定所述水性介质的花生过敏原的过敏原消化产物的特征。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.08 EP 16306642.6;2015.12.29 US 62/272,0941.一种用于测定水性介质中花生过敏原的特征的方法，包括：消化水性介质中存在的花生过敏原以产生过敏原消化产物；将过敏原消化产物片段化以产生肽片段，和测定所述水性介质的花生过敏原的过敏原消化产物的特征。2.权利要求1的方法，其中所述水性介质是溶出或释放介质。3.权利要求1的方法，其中所述水性介质是分析样品。4.权利要求1的方法，其中所述介质中花生过敏原的量低于约2μg/ml、低于约1.5μg/ml、低于约1μg/ml或低于约0.5μg/ml。5.权利要求1的方法，还包括将特征与特征标准比较的步骤。6.权利要求1的方法，其中所述过敏原消化产物的长度为约4个氨基酸至约50个氨基酸。7.权利要求1的方法，其中所述过敏原消化产物的长度为约6个氨基酸至约30个氨基酸。8.权利要求1的方法，其中所述过敏原消化产物的长度为约15个氨基酸至约20个氨基酸。9.权利要求1的方法，其中所述片段化过敏原消化产物和测定特征的步骤通过选自LC-MS、LC-MS-MS、nano-LC-MS-MS和nanoHPLC-MS-MS中的一种或任何组合的方法进行。10.权利要求1的方法，其中所述特征包含Arah1过敏原消化产物，其具有选自SEQIDNO:17、SEQIDNO:70、SEQIDNO:177、SEQIDNO:155、SEQIDNO:93和SEQIDNO:40的氨基酸序列。11.权利要求1的方法，其中所述特征包含来自Arah1、Arah2和Arah6的过敏原消化产物。12.权利要求1的方法，其中所述特征包含来自Arah1、Arah2、Arah3和Arah6的过敏原消化产物。13.权利要求12的方法，其中所述特征包含过敏原消化产物，其具有选自SEQIDNO:17、SEQIDNO:70、SEQIDNO:177、SEQIDNO:197、SEQIDNO:198、SEQIDNO:199、SEQIDNO:200、SEQIDNO:201、SEQIDNO:236和SEQIDNO:237的氨基酸序列。14.权利要求1的方法，其中所述过敏原消化产物存在于大部分Arah1的同种型中。15.权利要求1的方法，其中所述过敏原消化产物存在于至少90％的Arah1的同种型中。16.权利要求1的方法，其中所述过敏原消化产物存在于全部Arah1的同种型中。17.权利要求1的方法，其中所述过敏原消化产物存在于大部分Arah1、Arah2和Arah6的同种型中。18.权利要求1的方法，其中所述过敏原消化产物存在于大部分Arah1、Arah2、Arah3和Arah6的同种型中。19.权利要求1的方法，其中将所述花生过敏原使用选自胰蛋白酶、内蛋白酶Lys-C和内蛋白酶Arg-C的一种或多种蛋白酶消化。20.权利要求1的方法，其中所述水性介质进一步包含内标。21.权利要求1的方法，其中所述内标包含一种或多种重同位素。22.权利要求1的方法，其中所述特征包含不含遗漏的蛋白水解切割位点的过敏原消化产物。23.一种用于测定包含花生过敏原的水性介质的体外释放谱的方法，包括：在多个时间点中的每一个从所述水性...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·阿尔文，B·H·王，P·德蒙蒂尼，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国,FR