用于高分辨率地局部成像样品中的结构的方法，以便检测令人感兴趣的对象对变化的周围环境条件的反应技术

为了高分辨率地成像样品中的借助冷光标记物标记的结构，使对冷光标记物发射冷光产生影响的光(2)对准所述样品(8)，所述光具有如下强度分布：所述强度分布具有与强度最大值(3)相邻的零点(4)。以所述零点(4)扫描所述样品的待扫描的部分区域，并且记录从所述零点(4)的区域发射的冷光，并且将所述冷光配属于所述零点(4)在所述样品中的位置。在此，将令人感兴趣的对象的多个样本分别与所述样品(8)的待扫描的部分区域中的一个重叠地布置，并且使令人感兴趣的对象的多个样本承受变化的周围环境条件，以便检测所述令人感兴趣的对象对变化的周围环境条件作出的反应。在所述周围环境条件改变期间和/或在所述周围环境条件改变之前以及在所述周围环境条件改变之后，以相应的零点(4)扫描所述样品(8)的各个部分区域。在至少一个方向上如此限制所述样品的待扫描的部分区域的尺寸，使得所述尺寸不大于强度最大值(3)在所述方向上的间距(D0)的75％，在所述至少一个方向上，所述强度最大值(3)与所述零点(4)在所述样品中相邻。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于高分辨率地局部成像样品中的结构的方法，以便检测令人感兴趣的对象对变化的周围环境条件的反应
本专利技术涉及一种用于高分辨率地成像样品中的借助冷光标记物标记的结构的方法。本专利技术涉及高分辨率的扫描冷光显微术(Rasterlumineszenzlichtmikroskopie)领域，在该领域中，采取如下措施：这些措施允许，从相应样品发射的冷光以比冷光波长情况下的并且比可能的激发光波长情况下的衍射极限更高的位置分辨率配属于样品中的位置，借助可能的激发光将冷光标记物在空间上受限地激发到发射冷光。冷光标记物通常涉及荧光标记物，该荧光标记物在通过激发光激发之后发射作为冷光的荧光。然后谈及荧光显微术。
技术介绍
在根据独立权利要求的前序部分的已知方法和扫描冷光显微镜中，为了提高位置分辨率，使对冷光标记物发射冷光产生影响的光对准样品，该光具有如下强度分布：该强度分布具有与强度最大值相邻的零点。这种光通常涉及冷光阻抑光(lumineszenzlicht)，借助该冷光阻抑光，可以阻抑位于除零点位置之外的那些冷光标记物发射冷光。因此，可以将从样品发射的冷光配属于零点的位置，因为只有布置在那里的冷光标记物才能够发射冷光。因此在STED荧光显微术中，除了处于零点的区域中的那些荧光标记物之外，借助作为荧光阻抑光的刺激光(Stimulationslicht)通过受激发射将之前借助激发光所激发的荧光标记物重新抑制(abregen)，使得只有处于零点的区域内的荧光标记物能够发射随后测量到的荧光。因此，该荧光可以配属于样品中的零点的位置。通过以零点扫描样品来确定样品中的荧光标记物的空间分布。以这种方式，可以对样品中的借助荧光标记物所标记的结构的构造和空间分布进行成像。在GSD荧光显微术中，借助荧光阻抑光将零点的区域之外的那些荧光标记物转换到电子黑暗状态中，因此，这些荧光标记物无法通过激发光被激发到发射荧光。在RESOLFT荧光显微术中使用荧光阻抑光，该荧光阻抑光将除了零点的区域中的荧光标记物之外的那些光敏(photochrome)荧光标记物从荧光状态转换到非荧光状态中。在随后借助激发光激发荧光标记物时，相应地，只有荧光阻抑光的强度分布的零点的区域中的荧光标记物由激发光激发到发射荧光。因此，在此也能够将由样品中的荧光标记物发射的荧光配属于荧光阻抑光的强度分布的零点的位置。在目前所描述的所有高分辨率扫描冷光显微术的方法中，存在如下相当大的风险：相应样品中的冷光标记物暂时地或甚至持续地褪色、即失活，使得该冷光标记物不再发射冷光。这种风险基于以下事实：冷光阻抑光的强度必须被调节得很高，以便防止零点的区域之外的所有冷光标记物发射冷光并且同时严格限制零点的区域(冷光标记物仍能从其发射冷光)的空间尺寸。当冷光标记物接近冷光阻抑光的零点的区域时，也就是说，在冷光标记物首次到达零点的区域中并且因此首次记录到由该荧光标记物发射的冷光之前，该冷光阻抑光就已经以其高强度对样品中的荧光标记物产生影响。这可能导致：在所描述的方法中，无法使用易于褪色的冷光标记物，或至少无法使用冷光阻抑光的非常高的强度，该高强度例如对于位置分辨率的最大化是期望的。为了克服高分辨率扫描冷光显微术中所描述的暂时褪色以及尤其持续褪色的问题，已经采取了不同方法。DE102005027896A1说明，在STED荧光显微术中，将荧光阻抑光以具有相对较大的时间间隔的脉冲或以零点快速扫描相应样品时施加到样品上，使得样品的同一区域仅在优化的时间重复间距的情况下承受荧光阻抑光的高强度。以这种方式，提高了能够从样品获得的荧光的强度，因为显著降低了荧光标记物从被激发的中间状态通过进一步激发到达持续或仅缓慢衰减的黑暗状态中的速率。换句话说，以相对较大的重复间距借助荧光阻抑光的强度分布照射样品的每个单个区域，使在确定时间段内能够从整个样品获得的荧光量最大化。这种方法也降低荧光标记物褪色的倾向性，因为避免了对发生荧光标记物的光化学破坏的激发状态的严重占据。为了也能借助易于褪色的荧光标记物来执行高分辨率荧光显微术，DE102011051086A1提出，使扫描条件如此彼此协调，使得荧光以能够单个探测到的光子的形式从荧光阻抑光的强度分布的零点的区域中发射，所述扫描条件除了借助其扫描相应样品的扫描速度以外还包括：荧光阻抑光的强度分布的光强度特性和样品中的荧光标记物的浓度。样品中的借助荧光标记物标记的结构的图像由如下位置组成：这些位置在以零点对样品进行多次重复扫描期间已经配属于所探测到的光子。以这种方式，在荧光标记物由零点首次到达并且因此被检测到之前，降低了荧光标记物褪色的概率。这基于如下事实：褪色的概率与从各个荧光标记物获得的荧光强度相关联。因为荧光被最小化为单个光子，因此也使褪色的风险最小化。原则上，在由DE102011051086A1已知的方法中，在单个荧光标记物之前已经承受过邻接的强度最大值区域的高强度之后，单个荧光标记物才由荧光阻抑光的零点所达到。为了在高分辨率的扫描冷光显微术中也可以使用对于褪色敏感的物质，由WO2011/131591已知，借助测量前端(Messfront)经过如下样品：借助冷光标记物标记的令人感兴趣的结构处于该样品中。在此，光学信号的强度在测量前端的深度(该深度比该光学信号波长情况下的衍射极限小)上如此增大，使得冷光标记物的发射冷光的部分通过将冷光标记物转换到发光状态中而从不存在开始增加，并且该部分通过将冷光标记物转换到非发光状态中而重新降低至不存在。检测来自测量前端区域的冷光，并且将该冷光配属于该测量前端在样品中所配属的位置。在此，例如也可以以超出衍射极限的位置分辨率进行沿着测量前段的荧光配属，例如将所记录的光子配属于唯一的冷光标记物，这例如在已知为GSDIM的光显微术方法中进行。在扫描冷光显微术中，提高成像样品的令人感兴趣的结构时的速度的一种可能性是，借助冷光阻抑光的多个零点并行地扫描样品。在此，将从样品发射的冷光独立地配属于冷光阻抑光的各个零点。由DE102006009833B4已知，借助零点光栅来成像冷光阻抑光的强度分布，其方式是：将来自冷光阻抑光的两个彼此正交延伸的线条图案在样品中彼此重叠。在此，防止了线条图案之间的干涉，使得这些线条图案的强度分布相加。将冷光阻抑光的强度分布的与强度最大值邻接的期望零点保留在两个线光栅的线状零点的交叉点处。为了在零点的光栅状布置的区域中完全扫描样品，在至两个线条图案方向上最接近的零点的距离上移位每个零点就足够了。在此，在冷光标记物由零点所达到并且因此被初次检测到之前，样品中的大多数冷光标记物承受冷光阻抑光的高的光强度。因此，必须如此选择冷光标记物，使得这些冷光标记物能够承受高的光强度而不褪色。LiD等人的《Extended-resolutionstructuredilluminationimagingofendocyticandcytoskeletaldynamics》(Science，2015年8月28日，349(6251))公开一种用于对样品中的借助能够激活的荧光标记物标记的结构进行高分辨率成像的方法，其中，借助荧光激活光和荧光激发光的光强度分布的重合的(zusammenfallend)线状零点或面状零点在不同方向上依次扫描样品，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于高分辨率地成像样品(8)中的借助冷光标记物(56，57)标记的结构的方法，其中，使对所述冷光标记物(56，57)发射冷光产生影响的光对准所述样品(8)，所述光具有如下强度分布：所述强度分布具有与强度最大值(3)相邻的零点(4)，其中，以所述零点(4)扫描所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)，其中，记录从所述零点(4)的区域发射的冷光，并且将所述冷光配属于所述零点(4)在所述样品(8)中的位置，其特征在于，将令人感兴趣的对象(55)的多个样本分别与所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)中的一个重叠地布置，使所述令人感兴趣的对象(55)的多个样本承受变化的周围环境条件，以便检测所述令人感兴趣的对象(55)对所述变化的周围环境条件作出的反应，其中，在所述周围环境条件改变期间和/或在所述周围环境条件改变之前以及在所述周围环境条件改变之后，以相应的零点(4)扫描所述样品(8)的各个部分区域，并且在至少一个方向上如此限制所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)的尺寸，使得所述尺寸不大于所述强度最大值(3)在所述方向上的间距(D0)的75％，其中，在所述至少一个方向上，所述强度最大值(3)与所述零点(4)在所述样品中相邻。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.07 DE 102016104100.91.一种用于高分辨率地成像样品(8)中的借助冷光标记物(56，57)标记的结构的方法，其中，使对所述冷光标记物(56，57)发射冷光产生影响的光对准所述样品(8)，所述光具有如下强度分布：所述强度分布具有与强度最大值(3)相邻的零点(4)，其中，以所述零点(4)扫描所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)，其中，记录从所述零点(4)的区域发射的冷光，并且将所述冷光配属于所述零点(4)在所述样品(8)中的位置，其特征在于，将令人感兴趣的对象(55)的多个样本分别与所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)中的一个重叠地布置，使所述令人感兴趣的对象(55)的多个样本承受变化的周围环境条件，以便检测所述令人感兴趣的对象(55)对所述变化的周围环境条件作出的反应，其中，在所述周围环境条件改变期间和/或在所述周围环境条件改变之前以及在所述周围环境条件改变之后，以相应的零点(4)扫描所述样品(8)的各个部分区域，并且在至少一个方向上如此限制所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)的尺寸，使得所述尺寸不大于所述强度最大值(3)在所述方向上的间距(D0)的75％，其中，在所述至少一个方向上，所述强度最大值(3)与所述零点(4)在所述样品中相邻。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述样品(8)中的令人感兴趣的对象(55)的多个样本的不同子集承受不同的变化的周围环境条件。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过添加化学物质来改变所述周围环境条件。4.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将所述令人感兴趣的对象(55)的多个样本布置成相对于所述样品(8)的固定点(50)定义的图案(51)，并且以所述零点(4)相对于所述样品(8)的固定点(50)接近所述样品(8)的待扫描的部分区域。5.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，以所述零点(4)重复扫描所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，至少在重复扫描所述样品(8)的待扫描的部分区域时，将所述零点(4)布置在每个待扫描的部分区域(7)的不超过3n个或不超过2n个位置处，其中，n是如下空间方向的数量：在所述空间方向上，扫描所述样品(8)的待扫描的部分区域。7.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，以多个样本布置在所述样品(8)中的对象(55)从如下组中选择：所述组包括分子、蛋白质、复合物、突触、膜、细胞组织和病毒。8.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)的尺寸在至少一个方向上不大于所述强度最大值(3)在所述方向上的间距(D0)的50％、45％、25％或10％，在所述至少一个方向上，所述强度最大值(3)与所述零点(4)在所述样品中相邻。9.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)的尺寸在所述至少一个方向上不大于如下距离——在所述至少一个方向上，所述强度最大值(3)与所述零点(4)在所述样品中相邻：在所述距离上，所述光的强度(I)从所述零点(4)出发在所述方向上增大到所述光在相邻的强度最大值(3)中的强度(I)的50％、25％、10％或5％。10.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在扫描所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)之前，以其他方式成像所述样品(8)中的结构，以便确定所述待扫描的部分区域(7)在所述样品(8)中的位置，其中，可选地，在扫描所述样品(8)的待扫描的部分区域(7)之前，以所述零点(4)以所述光的至少低50％的强度和/或以至少高50％的扫描速度来扫描所述样品(8)的更大的部分区域。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，为了扫描所述样品(8)的更大的区域，使用与...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·W·黑尔，F·格特费尔特，V·韦斯特法尔，
申请(专利权)人：马克斯普朗克科学促进学会，
类型：发明
国别省市：德国,DE