使用数字全息显微术和来自外周血的未接触白细胞的高准确度五部分区分制造技术

本发明专利技术涉及用于使用微流控和数字全息显微术无标记物检测培养基中至少一个细胞的细胞类型的改进方法，以及具体用于执行该方法的设备。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用数字全息显微术和来自外周血的未接触白细胞的高准确度五部分区分
本专利技术涉及用于使用微流控和数字全息显微术无标记物检测培养基中至少一个细胞的细胞类型的改进方法，以及具体用于执行该方法的设备。
技术介绍
血液细胞体外诊断的一个实质部分是白细胞(WBC)的区分和计数。WBC细胞类型通常表示为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，这被称为血液学测试结果中WBC的三部分区分。粒细胞可以进一步划分成三种类型的粒细胞-嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。因此，五部分区分指的是外周血的五种主要白细胞类型。用诸如米氏散射分析(Miescatteranalysis)的无标记方法，通常三部分区分是可行的，但其不允许辨别粒细胞的类型。低角度和高角度下各个靶细胞的米氏散射通常用来辨别三部分区分的WBC。为了使红细胞的散射最小化，进行了红细胞的溶血。对于五部分区分结果而言，人们需要额外标记细胞核和颗粒以从嗜中性粒细胞中辨别嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。额外标记基于散射和吸收测量允许进一步辨别五部分区分的粒细胞。此方法可以自动执行并用在作为流式细胞仪工作的血液学分析仪中。通常，血液学分析用自动血液学分析仪来进行，并且-在模糊结果(标记结果)的情况下-对于手工区分诊断进行显微镜载玻片上Giemsa染色血液样品的显微镜检查。自动血液学分析仪(automatedhematologyanalyzer)的缺点是需要定义门以用于数据分析，其在病理导致散射信息偏移超过门限的情况下会导致标记样品。此外，用血液学分析仪，用户没有可以允许WBC的X-区分信息的图像信息，诸如血小板-白细胞聚集体或病理形态。对于在显微镜载玻片上固定且(例如全色地)染色的细胞的显微镜分析而言存在类似的限制，其通常局限于100WBC至200WBC最大值的分析。然而，在病理情况下，感兴趣的WBC细胞浓度可以跨越多于五个数量级(0.1细胞/μl至10,000细胞/μl)，但这对于不同WBC群体的充足统计量而言需要较大的血液量。进一步地，Giemsa染色的样品需要全血样品在显微镜载玻片上的固定、干燥和全色染色，即，额外的分析步骤。总之，较大的动态浓度范围不能由具有较低统计检力的血涂片分析来覆盖。此外，基于阻抗或米氏散射分析的血液学分析仪不能提供形态信息。deGrooth、Terstappen等人的US5,017,497用作血液记数器的基础，去极化侧对极化侧的散点图从嗜中性粒细胞中辨别了未固定的、未染色的嗜酸性粒细胞，这也在SHAPIRO、HOWERDM.：“实用流式细胞仪”，第四版，第278-9页和图7-2；第三版，第236-7页和图7-2也中有所描述。然而，一般地染色是参考方法并应用于五部分区分。进一步地，数字全息显微术(DHM)已经描述了关于白细胞的辨别，例如在DE102014200911A中-其作为关于使用数字全息显微术的白细胞辨别的参考结合在此；VERCRUYSEE、DRIES等人：在实验室芯片中“使用紧凑的无透镜成像流式细胞仪的未标记白细胞的三部分区分”，2015年，第15卷，第1123页-其报道了使用固定细胞用DHM的三部分区分；和US2014/0220622A1-在没有详细说明如何实现五部分区分的情况下，其就用于白细胞区分的DHM作了报道。然而，需要一种改进且可靠的、无标记的、优选地定量的以大量方式(具体以更高通量的方式)辨别白细胞的方法。
技术实现思路
本专利技术人使用微流控优化了显微方法以解决上面的问题，并且获得了用于在线监测并区分外周血样品中的血液细胞的系统。在第一方面中，本专利技术涉及用于无标记检测培养基中至少一个细胞的细胞类型的方法，其包括使包括至少一个细胞的培养基流入微流控设备(microfluidicdevice)中，通过数字全息显微设备(digitalholographicmicroscope)在微流控设备中获得至少一个细胞的图像，其中该图像在小于6μm的景深(depthoffield)下获得，并且测定至少一个细胞的细胞类型。本专利技术进一步涉及无标记检测培养基中至少一个细胞的细胞类型的设备，其包括-具有小于6μm的景深的数字全息显微设备；-微流控设备；以及-配置成测定至少一个细胞的细胞类型的检测系统。在不局限于此的情况下，本专利技术的进一步方面和实施例在从属权利要求中公开并可以从以下说明书、附图和示例中获取。附图说明附图应示出本专利技术的实施例并传达其进一步理解。与说明书相结合，它们用作本专利技术的概念和原理的解释。其它实施例和许多陈述的优点可以结合附图来衍生。附图的元件不一定是彼此相互成比例的。除非另有注明，否则相同的、功能上相当的和作用等同的特征和部件用相同的参考编号注明在附图的图中。图1示出了不同供体的白细胞的示例性流体动力学直径和体积。图2和图3示意性地示出了关于白细胞及其在流动细胞中定位的景深(DOF)考虑(在考虑图2中更小的淋巴细胞和图3中更大的单核细胞的情况下)。如图所示，WBC体积的平均最小值2/3应在物理DOF内，从而优选地允许关于最小白细胞z为约+/-2μm的公差。图4和图5示意性地示出了符合WBC分析需要的红血液细胞(RBC)的DOF和流动细胞定位考虑。定向效果可以通过层流来实现。图6至图8示出了使用具有不同波长、物镜与照明数值孔径(NA)和不同的横向分辨率的离轴DHM系统所获取的WBC图像。具体实施方式在第一方面中，本专利技术涉及用于无标记检测培养基中至少一个细胞的细胞类型的方法，其包括使包括至少一个细胞的培养基流入微流控设备中，在微流控设备中通过数字全息显微设备获得至少一个细胞的图像，其中该图像在小于6μm的景深情况下获得，并且测定至少一个细胞的细胞类型。在该方法以及本设备中，数字全息显微设备不受具体限制，并且可以使用任何适合的数字全息显微术。具体地，可从一个图像重建数据的数字全息显微术对于高通量而言是优选的。对于诸如WBC的细胞的无标记辨别而言，应用了诸如五部分区分和更多部分区分(基于聚集体、胚细胞、凋亡细胞、肿瘤细胞、激活的WBC等的额外辨别的X-diff)的数字全息显微术(DHM)。由此，WBC分类的工作流程可以如下：使用透射显微镜来获得图像，并且记录样品(即细胞)的干涉相位图案。从信息中重建细胞的图像，并且对数据进行分析以便还获得如细胞区室的生物信息。还可以测定细胞浓度、吸收以及如散射或荧光信息的进一步信息，例如如DE102014200911A中所描述。透射或可选反射中的DHM可以参考地用共同的束设定来进行，例如由NatanShaked/TelAviv大学、Ovizio/比利时、Anand/Baroda大学所用。对比度是培养基与细胞之间以及在亚细胞组分之间的细微折射率变化的散射效应的结果。亚细胞组分的定量和积分相位信息与流式细胞术的米氏散射测量有关。然而，用DHM的图像分析和无染色的工作流程允许进行接近体内状况的“活”细胞的血液学分析。数字全息显微术使用参考束和检测束来工作，其可以以不同(例如同轴、离轴、垂直等)设置来适合地设定。优选地，测量以离轴方式来执行，从而可以实现更简单和更稳健的干扰设置并且测量距离较短，从而使噪声最小化。因此，根据某些实施方式，数字全息显微设备的参考束和检测束是离轴的。而且，优选地测量在传输模式中来完成。景深优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于无标记检测培养基中至少一个细胞的细胞类型的方法，包括使包含至少一个细胞的培养基流入微流控设备中，通过数字全息显微设备在所述微流控设备中获得所述至少一个细胞的图像，其中所述图像以小于6μm的景深获得，以及测定所述至少一个细胞的细胞类型。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.16 EP 16160664.5;2016.08.05 EP 16182979.11.一种用于无标记检测培养基中至少一个细胞的细胞类型的方法，包括使包含至少一个细胞的培养基流入微流控设备中，通过数字全息显微设备在所述微流控设备中获得所述至少一个细胞的图像，其中所述图像以小于6μm的景深获得，以及测定所述至少一个细胞的细胞类型。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述图像以小于0.6μm的横向分辨率获得。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述检测在使包括所述至少一个细胞的所述培养基流动穿过所述微流控设备时执行。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述微流控设备中的流在其中获得所述至少一个细胞的所述图像的区域中至少是层流。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述微流控设备在其中获得所述至少一个细胞的所述图像的所述区域中包括微通道，其中所述层流由至少一种鞘流产生。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述微通道的垂直于所述数字全息显微设备的参考束和/或检测束的波前的表面基本上是平...

【专利技术属性】
技术研发人员：诺哈·尤斯里·艾尔泽希里，奥利弗·海登，阿里·卡门，卢卡斯·里克特，曼弗雷德·施坦策尔，马蒂亚斯·乌格勒，丹尼拉·塞德尔，加比·马夸特，奥利弗·施密特，
申请(专利权)人：西门子保健有限责任公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE