用于治疗血红蛋白病的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及用于治疗血红蛋白病的基因组编辑系统、试剂和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗血红蛋白病的组合物和方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年12月28日提交的美国临时专利申请号62/271,968以及2016年6月8日提交的美国临时专利申请号62/347,484的优先权。这些申请的全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)在细菌中作为适应性免疫系统进化以抵御病毒攻击。在暴露于病毒时，病毒DNA的短区段被整合到细菌基因组的CRISPR基因座中。RNA从包含病毒序列的CRISPR基因座的部分转录。该RNA(其含有与病毒基因组互补的序列)介导Cas9蛋白靶向病毒基因组中的序列。Cas9蛋白切割病毒靶标并由此使其沉默。最近，CRISPR/Cas系统已经适用于真核细胞中的基因组编辑。位点特异性单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)的引入允许通过例如非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来改变靶序列。
技术实现思路
不受理论束缚，本专利技术部分地基于以下发现：CRISPR系统(例如Cas9CRISPR系统，例如如本文所述)可用于修饰细胞(例如造血干细胞和祖细胞(HSPC))以增加胎儿血红蛋白(HbF)表达和/或降低β珠蛋白(例如具有致病性突变的β珠蛋白基因)的表达，并且此类细胞可用于治疗血红蛋白病，例如镰状细胞疾病和β地中海贫血。因此，在一方面，本专利技术提供了包含一种或多种(例如一种)如本文所述的gRNA分子的CRISPR系统(例如CasCRISPR系统，例如Cas9CRISPR系统，例如酿脓链球菌Cas9CRISPR系统)。本文所述的任何gRNA分子均可用于此类系统以及本文所述的方法和细胞中。在一方面，本专利技术提供了包含tracr和crRNA的gRNA分子，其中该crRNA包含与BCL11A基因、BCL11a增强子或HFPH区域的靶序列互补的靶向结构域。在另一方面，本专利技术提供了包含靶向结构域的gRNA分子，该靶向结构域与BCL11A基因的靶序列互补，例如与BCL11a编码区内(例如在BCL11a外显子内，例如在BCL11a外显子2内)的靶序列互补。在实施例中，该gRNA包含靶向结构域，该靶向结构域包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:85或SEQIDNO:400至SEQIDNO:1231中的任何一个，例如由其组成。在另一方面，本专利技术提供了包含靶向结构域的gRNA分子，该靶向结构域与BCL11A增强子的靶序列互补。在实施例中，该gRNA包含靶向结构域，该靶向结构域包含SEQIDNO:1232至SEQIDNO:1499中的任何一个，例如由其组成。在实施例中，对于BCL11a增强子的靶序列而言的gRNA是对于BCL11a增强子的+58区域内的靶序列而言的，并且该靶向结构域包含SEQIDNO:182至SEQIDNO:277或SEQIDNO:334至SEQIDNO:341中的任何一个，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:341、SEQIDNO:246、SEQIDNO:248、SEQIDNO:247、SEQIDNO:245、SEQIDNO:249、SEQIDNO:244、SEQIDNO:199、SEQIDNO:251、SEQIDNO:250、SEQIDNO:334、SEQIDNO:185、SEQIDNO:186、SEQIDNO:336、或SEQIDNO:337中的任何一个，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:248，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:247，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:245，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:336，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:337，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:338，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:335，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:252，例如由其组成。在一个实施例中，该gRNA是包含crRNA和tracr的dgRNA，该crRNA例如从5'至3'包含SEQIDNO:248-SEQIDNO:6607，例如由其组成，并且该tracr例如从5'至3'包含SEQIDNO:6660，例如由其组成。在一个实施例中，该gRNA是包含crRNA和tracr的dgRNA，该crRNA例如从5'至3'包含SEQIDNO:247-SEQIDNO:6607，例如由其组成，并且该tracr例如从5'至3'包含SEQIDNO:6660，例如由其组成。在一个实施例中，该gRNA分子是sgRNA分子并且例如从5'至3'包含SEQIDNO:338-SEQIDNO:6604-UUUU，例如由其组成。在一个实施例中，该gRNA分子是sgRNA分子并且例如从5'至3'包含SEQIDNO:335-SEQIDNO:6604-UUUU，例如由其组成。在一个实施例中，该gRNA分子是sgRNA分子并且例如从5'至3'包含SEQIDNO:336-SEQIDNO:6604-UUUU，例如由其组成。在一个实施例中，该gRNA分子是sgRNA分子并且例如从5'至3'包含SEQIDNO:245-SEQIDNO:6604-UUUU，例如由其组成。在一个实施例中，该gRNA分子是sgRNA分子并且例如从5'至3'包含SEQIDNO:337-SEQIDNO:6604-UUUU，例如由其组成。在一个实施例中，该gRNA分子是sgRNA分子并且例如从5'至3'包含SEQIDNO:252-SEQIDNO:6604-UUUU，例如由其组成。在实施例中，对于BCL11a增强子的靶序列而言的gRNA是对于BCL11a增强子的+62区域内的靶序列而言的，并且该靶向结构域包含SEQIDNO:278至SEQIDNO:333中的任何一个，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:318、SEQIDNO:312、SEQIDNO:313、SEQIDNO:294、SEQIDNO:310、SEQIDNO:319、SEQIDNO:298、SEQIDNO:322、SEQIDNO:311、SEQIDNO:315、SEQIDNO:290、SEQIDNO:317、SEQIDNO:309、SEQIDNO:289、或SEQIDNO:281中的任何一个，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:318，例如由其组成。在实施例中，对于BCL11a增强子的靶序列而言的gRNA是对于BCL11a增强子的+55区域内的靶序列而言的，并且该靶向结构域包括SEQIDNO:1596至SEQIDNO:1691中的任何一个，例如由其组成。在实施例中，该靶向结构域包含SEQIDNO:1683、SEQIDNO:1638、SEQIDNO:1647、SEQIDNO:1609、SEQIDNO:1621、SEQIDNO:1617、SEQIDNO:1654、SEQIDNO:1631、SEQIDNO:1620、SEQIDNO:1637、SEQIDNO:1612、SEQIDNO:1656、SEQIDNO:1619、SEQIDNO:1675、SEQIDNO:1645、SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种gRNA分子，该gRNA分子包含tracr和crRNA，其中该crRNA包含与BCL11A基因(例如人BCL11a基因)、BCL11a增强子(例如人BCL11a增强子)、或HFPH区域(例如人HPFH区域)的靶序列互补的靶向结构域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.28 US 62/271,968;2016.06.08 US 62/347,4841.一种gRNA分子，该gRNA分子包含tracr和crRNA，其中该crRNA包含与BCL11A基因(例如人BCL11a基因)、BCL11a增强子(例如人BCL11a增强子)、或HFPH区域(例如人HPFH区域)的靶序列互补的靶向结构域。2.如权利要求1所述的gRNA分子，其中该靶序列是BCL11A基因的靶序列，并且该靶向结构域包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:85或SEQIDNO:400至SEQIDNO:1231中的任何一个，例如由其组成。3.如权利要求1所述的gRNA分子，其中该靶序列是BCL11a增强子的靶序列，并且该靶向结构域包含SEQIDNO:1232至SEQIDNO:1499中的任何一个，例如由其组成。4.如权利要求1所述的gRNA分子，其中该靶序列是BCL11a增强子的靶序列，并且该靶向结构域包含SEQIDNO:182至SEQIDNO:277或SEQIDNO:334至SEQIDNO:341中的任何一个，例如由其组成。5.如权利要求4所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:341、SEQIDNO:246、SEQIDNO:248、SEQIDNO:247、SEQIDNO:245、SEQIDNO:249、SEQIDNO:244、SEQIDNO:199、SEQIDNO:251、SEQIDNO:250、SEQIDNO:334、SEQIDNO:185、SEQIDNO:186、SEQIDNO:336、或SEQIDNO:337中的任何一个，例如由其组成。6.如权利要求4所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:247、SEQIDNO:248、SEQIDNO:335、SEQIDNO:336、SEQIDNO:337、或SEQIDNO:338中的任何一个，例如由其组成。7.如权利要求4所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:248或SEQIDNO:338中的任何一个，例如由其组成。8.如权利要求4所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:248，例如由其组成。9.如权利要求4所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:338，例如由其组成。10.如权利要求1所述的gRNA分子，其中该靶序列是BCL11a增强子的靶序列，并且该靶向结构域包含SEQIDNO:278至SEQIDNO:333中的任何一个，例如由其组成。11.如权利要求10所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:318、SEQIDNO:312、SEQIDNO:313、SEQIDNO:294、SEQIDNO:310、SEQIDNO:319、SEQIDNO:298、SEQIDNO:322、SEQIDNO:311、SEQIDNO:315、SEQIDNO:290、SEQIDNO:317、SEQIDNO:309、SEQIDNO:289、或SEQIDNO:281中的任何一个，例如由其组成。12.如权利要求10所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:318，例如由其组成。13.如权利要求1所述的gRNA分子，其中该靶序列是BCL11a增强子的靶序列，并且该靶向结构域包含SEQIDNO:1596至SEQIDNO:1691中的任何一个，例如由其组成。14.如权利要求13所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:1683、SEQIDNO:1638、SEQIDNO:1647、SEQIDNO:1609、SEQIDNO:1621、SEQIDNO:1617、SEQIDNO:1654、SEQIDNO:1631、SEQIDNO:1620、SEQIDNO:1637、SEQIDNO:1612、SEQIDNO:1656、SEQIDNO:1619、SEQIDNO:1675、SEQIDNO:1645、SEQIDNO:1598、SEQIDNO:1599、SEQIDNO:1663、SEQIDNO:1677、或SEQIDNO:1626中的任何一个，例如由其组成。15.如权利要求1所述的gRNA分子，其中该靶序列是HFPH区域(例如法国HPFH区域(FrenchHPFHregion))的靶序列，并且该靶向结构域包含SEQIDNO:86至SEQIDNO:181、SEQIDNO:1500至SEQIDNO:1595、或SEQIDNO:1692至SEQIDNO:1761中的任何一个，例如由其组成。16.如权利要求15所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:100、SEQIDNO:165、SEQIDNO:113、SEQIDNO:99、SEQIDNO:112、SEQIDNO:98、SEQIDNO:1580、SEQIDNO:106、SEQIDNO:1503、SEQIDNO:1589、SEQIDNO:160、SEQIDNO:1537、SEQIDNO:159、SEQIDNO:101、SEQIDNO:162、SEQIDNO:104、SEQIDNO:138、SEQIDNO:1536、SEQIDNO:1539、SEQIDNO:1585中的任何一个，例如由其组成。17.如权利要求15所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:1505、SEQIDNO:1589、SEQIDNO:1700、或SEQIDNO:1750中的任何一个，例如由其组成。18.如权利要求15所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含SEQIDNO:100、SEQIDNO:165、或SEQIDNO:113中的任何一个，例如由其组成。19.如权利要求2-18中任一项所述的gRNA分子，其中该靶向结构域包含任何一个所列举的靶向结构域序列的17、18、19、20、21、22、23、或24个连续核酸，例如由其组成。20.如权利要求16所述的gRNA分子，其中任何一个所列举的靶向结构域序列的该17、18、19、20、21、22、23、或24个连续核酸是布置于所列举的靶向结构域序列的3'端的17、18、19、20、21、22、23、或24个连续核酸。21.如权利要求16所述的gRNA分子，其中任何一个所列举的靶向结构域序列的该17、18、19、20、21、22、23、或24个连续核酸是布置于所列举的靶向结构域序列的5'端的17、18、19、20、21、22、23、或24个连续核酸。22.如权利要求16所述的gRNA分子，其中任何一个所列举的靶向结构域序列的该17、18、19、20、21、22、23、或24个连续核酸不包含所列举的靶向结构域序列的5'或3'核酸。23.如权利要求2-22中任一项所述的gRNA分子，其中该靶向结构域由所列举的靶向结构域序列组成。24.如先前权利要求中任一项所述的gRNA分子，其中该crRNA的部分和该tracr的部分杂交形成标志杆(flagpole)，该标志杆包含SEQIDNO:6584或6585。25.如权利要求24所述的gRNA分子，其中该标志杆进一步包含位于该标志杆的crRNA部分的3'的第一标志杆延伸部，其中所述第一标志杆延伸部包含SEQIDNO:6586。26.如权利要求24或25所述的gRNA分子，其中该标志杆进一步包含位于该标志杆的crRNA部分的3'的第二标志杆延伸部和如果存在，该第一标志杆延伸部，其中所述第二标志杆延伸部包含SEQIDNO:6587。27.如权利要求1-26中任一项所述的gRNA分子，其中该tracr包含SEQIDNO:6660或SEQIDNO:6661。28.如权利要求1-26中任一项所述的gRNA分子，其中该tracr包含SEQIDNO:7812，任选地在3'端进一步包含另外的1、2、3、4、5、6、或7个尿嘧啶(U)核苷酸。29.如权利要求1-28中任一项所述的gRNA分子，其中该crRNA从5'至3'包含[靶向结构域]-：a)SEQIDNO:6584；b)SEQIDNO:6585；c)SEQIDNO:6605；d)SEQIDNO:6606；e)SEQIDNO:6607；f)SEQIDNO:6608；或者g)SEQIDNO:7806。30.如权利要求1-23或29中任一项所述的gRNA分子，其中该tracr从5’至3’包含：a)SEQIDNO:6589；b)SEQIDNO:6590；c)SEQIDNO:6609；d)SEQIDNO:6610；e)SEQIDNO:6660；f)SEQIDNO:6661；g)SEQIDNO:7812；h)SEQIDNO:7807；i)SEQIDNO:7808；j)SEQIDNO:7809；k)以上a)至j)中的任一个，在3'端进一步包含至少1、2、3、4、5、6或7个尿嘧啶(U)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、或7个尿嘧啶(U)核苷酸；l)以上a)至k)中的任一个，在3'端进一步包含至少1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、或7个腺嘌呤(A)核苷酸；或者m)以上a)至l)中的任一个，在5'端(例如在5'末端)进一步包含至少1、2、3、4、5、6或7个腺嘌呤(A)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、或7个腺嘌呤(A)核苷酸。31.如权利要求1-23中任一项所述的gRNA分子，其中该靶向结构域和该tracr被布置于分开的核酸分子上，并且其中包含该靶向结构域的核酸分子包含任选地紧邻该靶向结构域的3'布置的SEQIDNO:6607，并且包含该tracr的核酸分子包含SEQIDNO:6660，例如由其组成。32.如权利要求27-28中任一项所述的gRNA分子，其中该标志杆的crRNA部分包含SEQIDNO:6607或SEQIDNO:6608。33.如权利要求1-26中任一项所述的gRNA分子，其中该tracr包含SEQIDNO:6589或6590和任选的布置于SEQIDNO:6589或6590的5'的第一tracr延伸部，如果存在第一标志杆延伸部的话，所述第一tracr延伸部包含SEQIDNO:6591。34.如权利要求1-33中任一项所述的gRNA分子，其中该靶向结构域和该tracr被布置于分开的核酸分子上。35.如权利要求1-33中任一项所述的gRNA分子，其中该靶向结构域和该tracr被布置于单个核酸分子上，并且其中该tracr被布置于该靶向结构域的3'。36.如权利要求35所述的gRNA分子，该gRNA分子进一步包含布置于该靶向结构域的3'且布置于该tracr的5'的环。37.如权利要求36所述的gRNA分子，其中该环包含SEQIDNO:6588。38.如权利要求1-23中任一项所述的gRNA分子，该gRNA分子从5'至3'包含[靶向结构域]-：(a)SEQIDNO:6601；(b)SEQIDNO:6602；(c)SEQIDNO:6603；(d)SEQIDNO:6604；(e)SEQIDNO:7811；或者(f)以上(a)至(e)中的任一个，在3'端进一步包含1、2、3、4、5、6或7个尿嘧啶(U)核苷酸。39.如权利要求1-40中任一项所述的gRNA分子，其中该靶向结构域和该tracr被布置于单个核酸分子上，并且其中所述核酸分子包含所述靶向结构域和任选地紧邻所述靶向结构域的3'布置的SEQIDNO:7811，例如由其组成。40.如权利要求1-39中任一项所述的gRNA分子，其中一种或任选地多于一种包含该gRNA分子的核酸分子包含：a)在所述一种或多种核酸分子的3'端的一个或多个，例如三个硫代磷酸酯修饰；b)在所述一种或多种核酸分子的5'端的一个或多个，例如三个硫代磷酸酯修饰；c)在所述一种或多种核酸分子的3'端的一个或多个，例如三个2'-O-甲基修饰；d)在所述一种或多种核酸分子的5'端的一个或多个，例如三个2'-O-甲基修饰；e)在所述一种或多种核酸分子的相对于末端的第4个、相对于末端的第3个和相对于末端的第2个3'残基的每个处的2’O-甲基修饰；f)在所述一种或多种核酸分子的相对于末端的第4个、相对于末端的第3个和相对于末端的第2个5'残基的每个处的2’O-甲基修饰；或者f)其任何组合。41.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:342；(b)SEQIDNO:343；或者(c)SEQIDNO:1762。42.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:344，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:344，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:345，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:345，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。43.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:347；(b)SEQIDNO:348；或者(c)SEQIDNO:1763。44.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:349，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:349，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:350，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:350，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。45.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:351；(b)SEQIDNO:352；或者(c)SEQIDNO:1764。46.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:353，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:353，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:354，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:354，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。47.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:355；(b)SEQIDNO:356；或者(c)SEQIDNO:1765。48.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:357，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:357，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:358，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:358，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。49.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:359；(b)SEQIDNO:360；或者(c)SEQIDNO:1766。50.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:361，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:361，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:362，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:362，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。51.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:363；(b)SEQIDNO:364；或者(c)SEQIDNO:1767。52.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:365，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:365，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:366，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:366，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。53.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:367；(b)SEQIDNO:368；或者(c)SEQIDNO:1768。54.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:369，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:369，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:370，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:370，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。55.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:371；(b)SEQIDNO:372；或者(c)SEQIDNO:1769。56.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:373，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:373，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:374，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:374，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。57.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:375；(b)SEQIDNO:376；或者(c)SEQIDNO:1770。58.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:377，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:377，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:378，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:378，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。59.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:379；(b)SEQIDNO:380；或者(c)SEQIDNO:1771。60.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:381，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:381，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:382，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:382，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。61.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:383；(b)SEQIDNO:384；或者(c)SEQIDNO:1772。62.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:385，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:385，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:386，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:386，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。63.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:387；(b)SEQIDNO:388；或者(c)SEQIDNO:1773。64.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:389，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:389，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:390，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:390，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。65.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:391；(b)SEQIDNO:392；或者(c)SEQIDNO:1774。66.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:393，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:393，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:394，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:394，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。67.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下序列，例如由其组成：(a)SEQIDNO:395；(b)SEQIDNO:396；或者(c)SEQIDNO:1775。68.如权利要求1所述的gRNA分子，该gRNA分子包含以下，例如由其组成：(a)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:397，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；(b)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:397，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成；(c)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:398，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:6660，例如由其组成；或者(d)crRNA和tracr，该crRNA包含SEQIDNO:398，例如由其组成，并且该tracr包含SEQIDNO:346，例如由其组成。69.如权利要求1-68中任一项所述的gRNA分子，其中当将包含该gRNA分子的CRISPR系统(例如如本文所述的RNP)引入细胞中时，在与该gRNA分子的靶向结构域互补的靶序列处或其附近形成插入/缺失。70.如权利要求69所述的gRNA分子，其中该插入/缺失不包含GATA-1或TAL-1结合位点的核苷酸。71.如权利要求1-70中任一项所述的gRNA分子，其中当将包含该gRNA分子的CRISPR系统(例如如本文所述的RNP)引入细胞群中时，在该群的至少约40％，例如至少约50％、例如至少约60％、例如至少约70％、例如至少约80％、例如至少约90％、例如至少约95％、例如至少约96％、例如至少约97％、例如至少约98％、例如至少约99％的细胞中，在与该gRNA分子的靶向结构域互补的靶序列处或其附近形成插入/缺失。72.如权利要求1-68中任一项所述的gRNA分子，其中当将包含该gRNA分子的CRISPR系统(例如如本文所述的RNP)引入细胞群中时，在该群的至少约20％，例如至少约30％、例如至少约35％、例如至少约40％、例如至少约45％、例如至少约50％、例如至少约55％、例如至少约60％、例如至少约65％、例如至少约70％、例如至少约75％、例如至少约80％、例如至少约85％、例如至少约90％、例如至少约95％、例如至少约99％的细胞中，在与该gRNA分子的靶向结构域互补的靶序列处或其附近形成插入/缺失，该插入/缺失不包含GATA-1或TAL-1结合位点的核苷酸。73.如权利要求71-72中任一项所述的gRNA分子，其中在该群的至少约30％，例如至少约40％、例如至少约50％、例如至少约60％、例如至少约70％、例如至少约80％、例如至少约90％、例如至少约95％、例如至少约96％、例如至少约97％、例如至少约98％、例如至少约99％的细胞中，该插入/缺失是图25、表15、表26、表27或表37中任一个中列出的插入/缺失。74.如权利要求71-73中任一项所述的gRNA分子，其中所述细胞群中三个最常检测到的插入/缺失包括图25、表15、表26、表27或表37中任一个中列出的与任何gRNA分子相关的插入/缺失。75.如权利要求69-74中任一项所述的gRNA分子，其中该插入/缺失是如通过下一代测序(NGS)所测量的。76.如权利要求1-75中任一项所述的gRNA分子，其中当将包含该gRNA分子的CRISPR系统(例如如本文所述的RNP)引入细胞中时，胎儿血红蛋白在所述细胞或其子代，例如其类红细胞子代，例如其红细胞子代中的表达增加。77.如权利要求76所述的gRNA分子，其中胎儿血红蛋白在所述细胞或其子代，例如其类红细胞子代，例如其红细胞子代中的表达增加至少约20％，例如至少约30％、例如至少约40％、例如至少约50％、例如至少约60％、例如至少约70％、例如至少约80％、例如至少约90％、例如至少约95％、例如至少约96％、例如至少约97％、例如至少约98％、例如至少约99％。78.如权利要求76-77中任一项所述的gRNA分子，其中所述细胞或其子代，例如其类红细胞子代，例如其红细胞子代产生每个细胞至少约6皮克(例如，至少约7皮克、至少约8皮克、至少约9皮克、至少约10皮克、或从约8皮克至约9皮克、或从约9皮克至约10皮克)胎儿血红蛋白。79.如权利要求1-78中任一项所述的gRNA分子，其中当将包含该gRNA分子的CRISPR系统(例如如本文所述的RNP)引入细胞中时，在所述细胞中未形成脱靶插入/缺失，例如如通过下一代测序和/或核苷酸插入测定可检测到的。80.如权利要求1-78中任一项所述的gRNA分子，其中当将包含该gRNA分子的CRISPR系统(例如如本文所述的RNP)引入细胞群中时，在该细胞群的不多于约5％，例如不多于约1％、例如不多于约0.1％、例如不多于约0.01％的细胞中检测到脱靶插入/缺失，例如如通过下一代测序和/或核苷酸插入测定可检测到的。81.如权利要求69-80中任一项所述的gRNA分子，其中该细胞是(或细胞群包含)哺乳动物细胞、灵长类动物细胞、或人细胞，例如是人细胞。82.如权利要求81所述的gRNA分子，其中该细胞是(或细胞群包含)HSPC。83.如权利要求82所述的gRNA分子，其中该HSPC是CD34+。84.如权利要求83所述的gRNA分子，其中该HSPC是CD34+CD90+。85.如权利要求69-84中任一项所述的gRNA分子，其中该细胞相对于待施用所述细胞的患者是自体的。86.如权利要求69-84中任一项所述的gRNA分子，其中该细胞相对于待施用所述细胞的患者是同种异体的。87.一种组合物，该组合物包含：1)如权利要求1-86中任一项所述的一种或多种gRNA分子(包括第一gRNA分子)、和Cas9分子；2)如权利要求1-86中任一项所述的一种或多种gRNA分子(包括第一gRNA分子)、和编码Cas9分子的核酸；3)编码如权利要求1-86中任一项所述的一种或多种gRNA分子(包括第一gRNA分子)的核酸、和Cas9分子；4)编码如权利要求1-86中任一项所述的一种或多种gRNA分子(包括第一gRNA分子)的核酸、和编码Cas9分子的核酸；或者5)以上1)至4)中的任一个、和模板核酸；或者6)以上1)至4)中的任一个、和包含编码模板核酸的序列的核酸。88.一种包含如权利要求1-86中任一项所述的第一gRNA分子的组合物，该组合物进一步包含Cas9分子。89.如权利要求87或88所述的组合物，其中该Cas9分子是有活性或无活性的酿脓链球菌Cas9。90.如权利要求87-89所述的组合物，其中该Cas9分子包含SEQIDNO:6611。91.如权利要求87-89所述的组合物，其中该Cas9分子包含以下，例如由其组成：(a)SEQIDNO:7821；(b)SEQIDNO:7822；(c)SEQIDNO:7823；(d)SEQIDNO:7824；(e)SEQIDNO:7825；(f)...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·E·博伊塔诺，M·库克，L·B·科立克斯泰恩，R·莱斯卡博，C·S·米克宁，K·穆鲁巴，S·R·普利斯，J·斯尼德，S·C·史蒂文森，M·斯图尔特，Y·杨，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，因特利亚治疗公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH