用于HIV感染的RNA引导治疗的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及用于逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV‑1)中靶标序列的特异性裂解的组合物和方法。所述组合物可包括编码成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的核酸、以及与人免疫缺陷病毒中靶标序列互补的向导RNA序列，据信所述组合物可被输送至具有HIV感染或处于接触HIV感染风险下的受试者的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于HIV感染的RNA引导治疗的方法和组合物关于联邦资助研究的声明本专利技术在美国政府支持下，由国立卫生研究院(NIH)资助KamelKhalili(P30MH092177)、WenhuiHu(R01NS087971)、以及WenhuiHu和KamelKhalili(R01NS087971)完成。美国政府可以拥有本专利技术的某些权利。
本专利技术涉及用于逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV-1)中靶标序列的特异性裂解的组合物和方法。所述组合物可包括编码成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的核酸、以及与人免疫缺陷病毒中靶标序列互补的向导RNA序列，据信所述组合物可被输送至具有HIV感染或处于接触HIV感染风险下的受试者的细胞。
技术介绍
由于全世界内超过3,500万人感染HIV-1，且新感染以大于200万人每年的速率继续，因此，AIDS仍然是主要的公众卫生问题。抗逆转录病毒治疗(ART)有效地控制几乎所有HIV-1患者的病毒血症，并部分地修复原代宿主细胞(CD4+T细胞)，但无法成功地从潜伏性感染的T细胞消除HIV-1(Gandhi,etal,PLoSMed7,el000321(2010)；Palellaetal,NEnglJMed338,853-860(1998))。在潜伏性感染的CD4+T细胞中，被整合的前病毒DNA拷贝保持在休眠状态，但当T细胞被激活时，所述拷贝可被再次激活以产生能够复制的病毒，一旦抗逆转录病毒治疗中断，即导致病毒的快速回弹(Chun,etal.,Nature387,183-188(1997)；Chun,etal,ProcNatlAcadSciUSA100,1908-1913(2003)；Finzi,etal.,Science278,1295-1300(1997)；Hermankova,etal.,JVirol77,7388-7392(2003)；Siliciano,etal.,NatMed9,727-728(2003)；Wong,etal,Science278,1291-1295(1997))。因此，大多数感染HIV-1的个体，甚至是那些对ART应答良好的患者，由于感染HIV-1的储存细胞的持续存在，而必须维持终身的ART。在潜伏期，HIV感染的细胞产生很少或不产生病毒蛋白，因此避免了病毒的细胞病理效应并规避了被宿主免疫系统清除的命运。因为休眠的CD4+记忆T细胞隔室(Bruner,etal.,TrendsMicrobiol.23,192-203(2015))被认为是最卓越的潜伏性感染的细胞池，这一细胞隔室是以根除潜伏性HIV-1感染为目标的研究的关键焦点。最近，用来从这一细胞群中根除HIV-1的尝试已经主要使用“休克并杀死”途径，基本原理为，诱导CD4+记忆T细胞中的HIV再次激活，可通过细胞溶解或宿主免疫应答触发病毒生产细胞的消除。例如，对于建立病毒再激活而言，核染色质结构的后天性修饰是关键。因此，通过曲古抑菌素A(TrichostatinA(TSA))和伏立诺他(vorinostat)(SAHA)抑制组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)，导致细胞系中潜伏病毒的再激活(Quivy,etal.,JVirol76,11091-11093(2002)；Pearson,etal,JVirol82,12291-12303(2008)；Friedman,etal,JVirol85,9078-9089(2011))。据此，已经通过离体方式测试了其它HDACi，包括伏立诺他、丙戊酸、帕比司他(panobinostat)和罗米地辛(rombidepsin)，在最佳案例中，所述HDCi导致病毒血症的短暂增长(Archin,etal.,Nature487,482-485(2012)；Blazkova,etal,J.Infect.Dis206,765-769(2012))。同样，蛋白激酶C激动剂单独使用或与HDACi合用，可潜在地再激活HIV(Laird,etal,JClinInvest,125,1901-1912(2015)；Bullen,etal,NatureMed20:425-429(2014))。但是，这一途径存在多种限制：i)由于这一蓄积池中的大部分HIV基因组是非功能性的，并非所有被整合的前病毒均能产生可复制的病毒(Ho,etal.,Cell155,540-551(2013))；ii)通过病毒产物检验已经发现，从休眠的CD4+T细胞HIV-1蓄积池再次激活的CD4+T细胞的总数比通过基于PCR的检验检测到的被感染的细胞数小得多，表明并非这一蓄积池中的所有细胞均被激活(Eriksson,etal.,PLoSPathog9,e1003174(2013))；iii)细胞毒素T淋巴细胞(CTL)免疫应答的强健度不足以消除被再次激活的被感染细胞(Shan,etal.,Immunity36,491-501(2012))；以及iv)不能保护未感染的T细胞不被HIVgarnet，因此未感染的T细胞支持病毒重建。已经显示，成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的9(Cas9)核酸酶系统可用于宽范围的有机体内的基因编辑中，所述有机体包括酵母、果蝇属(Drosophila)、斑马鱼、线虫(C.elegans)和鼠，且所述系统已经被多个实验室广泛用于指向人类疾病的体内外研究中(DiCarloetal,NuclAcidsRes41:4336-4346(2013)；Gratzetal,Genetics194,1029-1035(2013)；Hwangetal,NatureBiotech31,227-229,(2013)；Wangetal,2013；Hu,etal,ProcNatlAcadSciUSA111,11461-11466(2014))。在CRISPR/Cas9系统中，组装了基因编辑复合物。每一复合物包括Cas9核酸酶和与前病毒DNA中的靶标序列互补的向导RNA(gRNA)。所述gRNA引导所述Cas9核酸酶啮合并裂解含有所述靶标序列的前病毒DNA链。所述Cas9/gRNA基因编辑复合物将一个或多个突变引入所述病毒DNA中。最近，所述CRISPR/Cas9系统已经被修饰以令识别位于HIV-1长末端重复(LTR)序列内的具体DNA序列称为可能(Hu,etal,ProcNatlAcadSciUSA111,11461-11466(2014)；Khalilietal,JNeurovirol21,310-321(2015))。需要扩展现有CRISPR/Cas9介导疗法的治疗能力，以包括从潜伏性感染患者T细胞根除被整合的HIV-1DNA；以及需要扩展诱导对处于感染风险下的患者T细胞内的HIV-1感染的抗性的能力。
技术实现思路
用于人免疫缺陷病毒(HIV)感染的治愈性策略包括，直接消除包括CD4+T细胞在内的HIV阳性细胞中前病毒基因组的方法，所述方法即便对宿主有害，但害处有限。一种具体实施例中，本专利技术提供用于治疗和预防逆转录病毒，尤其是人免疫缺陷病毒HIV-1感染的组合物和方法。所述组合物和方法采用形成复合物的Cas9和至少一种gRNA，在大多数案例中，所述复合物消除宿主T细胞基因组中的前病毒HIV。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，用于令整合入被人免疫缺陷病毒(HIV)潜伏性感染的宿主细胞基因组中的前病毒DNA失活，所述组合物包含：至少一种编码成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列，以及至少一种向导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA具有与前病毒HIV DNA的长末端重复序列(LTR)中的靶标序列互补的间隔序列序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.28 US 62/233,6181.一种组合物，用于令整合入被人免疫缺陷病毒(HIV)潜伏性感染的宿主细胞基因组中的前病毒DNA失活，所述组合物包含：至少一种编码成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸序列，以及至少一种向导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA具有与前病毒HIVDNA的长末端重复序列(LTR)中的靶标序列互补的间隔序列序列。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA包含与靶标核酸序列互补的核酸序列，所述核酸序列与SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66中的一个或多个序列及其片段、突变体、变体或组合的序列一致性为至少75％。3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA包含一核酸序列，所述核酸序列与SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66中的一个或多个序列及其片段、突变体、变体或组合的序列一致性为至少75％。4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA包含至少一个与靶标核酸序列互补的核酸序列，所述核酸序列包含SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66，及其片段、突变体、变体或组合。5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA包含至少一种核酸序列，所述至少一种核酸序列包含SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66，及其片段、突变体、变体或组合。6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述至少一种gRNA选自：gRNAA，其具有与前病毒DNA中的靶标序列SEQIDNO:1或靶标序列SEQIDNO:2互补的间隔序列序列；gRNAB，其具有与前病毒DNA中的靶标序列SEQIDNO:3或靶标序列SEQIDNO:4互补的间隔序列序列；或gRNAA与gRNAB的组合。7.一种用于令整合入被HIV潜伏性感染的宿主细胞基因组内的前病毒人免疫缺陷病毒(HIV)DNA失活的方法，所述方法包括下列步骤：以组合物处理所述宿主细胞，所述组合物包含成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶、以及至少一种向导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA具有与前病毒HIVDNA的长末端重复序列(LTR)中的靶标序列互补的间隔序列序列；以及令所述前病毒DNA失活。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述至少一种gRNA包含与靶标核酸序列互补的核酸序列，所述核酸序列与SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66中的一个或多个序列及其片段、突变体、变体或组合的序列一致性为至少75％。9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述至少一种gRNA包含核酸序列，所述核酸序列与SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66中的一个或多个序列及其片段、突变体、变体或组合的序列一致性为至少75％。10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述至少一种gRNA包含至少一个与靶标核酸序列互补的核酸序列，所述核酸序列包含SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66，及其片段、突变体、变体或组合。11.根据权利要求7所述的方法，其中，所述至少一种gRNA包含至少一种核酸序列，所述至少一种核酸序列包含SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66，及其片段、突变体、变体或组合。12.根据权利要求7所述的方法，其中，所述至少一种gRNA选自：gRNAA，其具有与前病毒DNA中的靶标序列SEQIDNO:1或靶标序列SEQIDNO:2互补的间隔序列序列；gRNAB，其具有与前病毒DNA中的靶标序列SEQIDNO:3或靶标序列SEQIDNO:4互补的间隔序列序列；或gRNAA与gRNAB的组合。13.一种用于令整合入潜伏性感染HIV的宿主细胞基因组内的前病毒人免疫缺陷病毒(HIV)DNA失活的慢病毒表达载体组合物，所述慢病毒表达载体组合物包括：编码成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶的单离的核酸、以及至少一种向导RNA(gRNA)，所述gRNA具有与前病毒HIVDNA的长末端重复序列(LTR)中的靶标序列互补的间隔序列序列，所述CRISPR相关的核酸内切酶和所述至少一种gRNA被包括于至少一种慢病毒表达载体中，其中，所述至少一种慢病毒表达载体诱导所述CRISPR相关的核酸内切酶和所述至少一种gRNA在宿主细胞内的表达。14.根据权利要求13所述的慢病毒表达载体组合物，其中，所述至少一种gRNA包含与靶标核酸序列互补的核酸序列，所述核酸序列与SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66中的一个或多个序列及其片段、突变体、变体或组合的序列一致性为至少75％。15.根据权利要求13所述的慢病毒表达载体组合物，其中，所述至少一种gRNA包含一核酸序列，所述核酸序列与SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66中的一个或多个序列及其片段、突变体、变体或组合的序列一致性为至少75％。16.根据权利要求13所述的慢病毒表达载体组合物，其中，所述至少一种gRNA包含至少一个与靶标核酸序列互补的核酸序列，所述核酸序列包含SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66，及其片段、突变体、变体或组合。17.根据权利要求13所述的慢病毒表达载体组合物，其中，所述至少一种gRNA包含至少一种核酸序列，所述至少一种核酸序列包含SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66，及其片段、突变体、变体或组合。18.根据权利要求13所述的慢病毒表达载体组合物，其中，所述至少一种gRNA选自：gRNAA，其具有与前病毒DNA中的靶标序列SEQIDNO:1或靶标序列SEQIDNO:2互补的间隔序列序列；gRNAB，其具有与前病毒DNA中的靶标序列SEQIDNO:3或靶标序列SEQIDNO:4互补的间隔序列序列；或gRNAA与gRNAB的组合。19.根据权利要求13所述的慢病毒表达载体组合物，其中，所述CRISPR相关的核酸内切酶和所述至少一种gRNA被整合入单一慢病毒表达载体中。20.根据权利要求13所述的慢病毒表达载体组合物，其中，所述CRISPR相关的核酸内切酶和所述至少一种gRNA被整合入独立的慢病毒表达载体中。21.一种消除被整合入潜伏性感染人免疫缺陷病毒(HIV)的经离体培养的宿主细胞基因组内的前病毒DNA的方法，所述方法包括下列步骤：获得潜伏性感染HIV的宿主细胞群，其中，前病毒HIVDNA被整合入所述宿主细胞基因组内；离体培养所述宿主细胞；以组合物处理所述宿主细胞，所述组合物包含成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶、以及至少一种向导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA具有与前病毒HIVDNA的长末端重复序列(LTR)中的靶标序列互补的间隔序列序列；以及从所述宿主细胞基因组消除所述前病毒DNA。22.根据权利要求21的方法，其中，所述获得宿主细胞群的步骤进一步定义为获得人类宿主细胞群。23.根据权利要求21的方法，其中，所述获得宿主细胞群的步骤进一步定义为获得人类外周血单核细胞、或获得CD4+T细胞群。24.根据权利要求21的方法，其中，所述至少一种gRNA包含与靶标核酸序列互补的核酸序列，所述核酸序列与SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66中的一个或多个序列及其片段、突变体、变体或组合的序列一致性为至少75％。25.根据权利要求21的方法，其中，所述至少一种gRNA包含一核酸序列，所述核酸序列与SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66中的一个或多个序列及其片段、突变体、变体或组合的序列一致性为至少75％。26.根据权利要求21的方法，其中，所述至少一种gRNA包含至少一个与靶标核酸序列互补的核酸序列，所述核酸序列包含SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66，及其片段、突变体、变体或组合。27.根据权利要求21的方法，其中，所述至少一种gRNA包含至少一种核酸序列，所述至少一种核酸序列包含SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66，及其片段、突变体、变体或组合。28.根据权利要求21的方法，其中，所述至少一种gRNA选自：gRNAA，其具有与前病毒DNA中的靶标序列SEQIDNO:1或靶标序列SEQIDNO:2互补的间隔序列序列；gRNAB，其具有与前病毒DNA中的靶标序列SEQIDNO:3或靶标序列SEQIDNO:4互补的间隔序列序列；或gRNAA与gRNAB的组合。29.根据权利要求21的方法，其中，所述处理步骤进一步包括在潜伏性感染的T细胞内表达所述CRISPR相关的核酸内切酶和所述至少一种向导RNA(gRNA)的步骤。30.一种治疗具有潜伏性人免疫缺陷病毒(HIV)感染的T细胞的患者的方法，所述方法包括下列步骤：从所述患者获得包括潜伏性感染的T细胞的细胞群，其中，前病毒HIVDNA被整合入所述T细胞基因组内；离体培养所述潜伏性感染的T细胞；以组合物处理所述潜伏性感染的T细胞，所述组合物包含成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关的核酸内切酶、以及至少一种向导RNA(gRNA)，所述至少一种gRNA具有与前病毒HIVDNA的长末端重复序列(LTR)中的靶标序列互补的间隔序列序列；从所述T细胞基因组消除被整合的前病毒HIVDNA；产生HIV被消除的T细胞群；将所述HIV被消除的T细胞群输注入所述患者体内；以及处理所述患者。31.根据权利要求30的方法，其中，所述获得潜伏性感染的T细胞群的步骤进一步定义为获得人类外周血单核细胞群、或获得CD4+T细胞群。32.根据权利要求30的方法，其中，所述至少一种gRNA包含与靶标核酸序列互补的核酸序列，所述核酸序列与SEQIDNOS:1至SEQIDNOS:66中...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·哈利利，W·胡，
申请(专利权)人：天普大学联邦高等教育系统，
类型：发明
国别省市：美国,US