配体诱导的细胞表达的微流体分析制造技术

本发明专利技术涉及微流体领域，并且具体涉及分析响应于在相同微流体区室中表达的配体的细胞的基因表达。通过对细胞和产生配体的表达系统的转录组进行条形码化，可以辨别配体对细胞表达的影响。本发明专利技术提供了用于该目的的微流体区室和方法。

Ligand induced microfluidic analysis of cell expression

The present invention relates to the field of microfluids, and in particular to the analysis of gene expression in cells responding to ligands expressed in the same microfluidic compartment. The effect of ligands on cell expression can be identified by barcoding the transcriptome of cell and ligand-producing expression system. The present invention provides a microfluidic compartment and method for this purpose.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】配体诱导的细胞表达的微流体分析专利
本专利技术涉及微流体领域，并且具体涉及分析响应于在相同微流体区室中表达的配体的细胞的基因表达。通过对细胞和产生配体的表达系统的转录组进行条形码化，可以辨别配体对细胞表达的影响。本专利技术提供了用于该目的的微流体区室和方法。专利技术背景基于区室的微流体(诸如基于微滴的微流体)微滴具有用于高通量筛选应用的巨大潜力。将单细胞包封至区室中允许以非常高的通量(例如每天高达数十万个样品)筛选细胞产物(诸如抗体)。单细胞RNA测序，也称为RNAseq，已经获得了许多科学和商业关注。它的目标是在单细胞水平上分析总体基因表达模式，从而允许分析和揭示异源群体中的不同细胞类型(诸如干细胞、肿瘤或发育中的胚胎)。Fluidigm公司已成为该技术的市场领导者，为单细胞RNAseq提供基于阀门的微流体解决方案。它们的C1系统可以在一次运行中处理多达96个细胞，并且该平台的下一代将具有一次运转多达800个细胞的通量。并行的，已经开发了纳米孔(Fan,H.C.,G.K.Fu,和S.P.A.Fodor,Science,2015.347(6222):第628页)和基于微滴的微流体技术(Macosko,E.Z.等人,Cell,2015.161(5):第1202-14页；Klein,A.M.,等人,Cell,2015.161(5):第1187-201页；Rotem,A.,等人,NatBiotechnol,2015.33(11):第1165-72页)，使得对于RNAseq或ChiPseq，能够处理多达10,000个细胞。在这些系统中，单细胞连同展示具有独特条形码的聚T核苷酸的单个珠子被包封至微流体微滴或纳米孔中(图1)。包封后，将细胞裂解并且所有细胞mRNA与条形码化的聚T引物杂交，从而确保与条形码的物理连接。在该阶段或在微滴内进行另外的逆转录步骤之后，可汇集所有样品并应用于下一代测序。由于条形码化，仍然可以区分单个细胞的表达模式，从而揭示群体内的差异。现有技术的单细胞测序技术和研究只专注于单独表征单细胞。然而，它们没有旨在共包封两种不同的细胞并同时对它们的转录组进行测序。此类将两种不同的细胞类型共包封至相同的微滴中并用相同的条形码标记这两种细胞类型的mRNA具有巨大的生物医学潜力：它允许分析细胞-细胞相互作用，例如细胞A如何对细胞B或由细胞B分泌的因子的存在作出反应，并且特别可用于以高度复用的(multiplexed)方式筛选遗传编码的药物候选物(诸如单克隆抗体，其年销售额超过500亿美元)。为此，本专利技术人实施了一种新型筛选方法，其允许分析响应于由细胞表达的未知配体的细胞表达，其中可以测试数百种不同的未知配体对细胞表达的影响，并且其中可以确定配体的身份并将其与细胞及其基因表达相联系，全部同时进行。例如，作为起点，可以用人癌细胞或其膜提取物免疫动物。随后，基于将单个浆细胞和单个癌细胞连同展示携带独特条形码(对于每个珠并因此对于每个区室，不同的条形码)的聚T引物的单个珠共区室化至区室中，可以分离分泌针对数百或甚至数千个已知或迄今未被表征的细胞表位和受体的抗体的浆细胞并将其应用于筛选。这与单细胞RNAseq的先前使用根本不同，单个细胞RNAseq先前使用的目的在于仅特定包封单个细胞，并且认为将多于一个细胞共区室化至区室中为不希望的事故。在产生容纳浆细胞和癌细胞的区室之后，可以孵育样品以允许有效分泌作用于靶细胞的抗体。众所周知，抗体不仅可以与表面受体结合，而且还可以引发信号级联，最终导致表达谱改变(Silva,H.M.,等人,ImmunolLett,2009.125(2):第129-36页；Franke,A.,等人,PLoSOne,2011.6(2):第e16596页)。在孵育期后，可以在区室内裂解浆细胞和癌细胞，并且在区室中细胞mRNA与条形码化的聚T引物杂交。这确保了每个区室中两种细胞类型的mRNA与相同的条形码物理连接/用相同的条形码标记。换言之，动物血浆细胞的抗体编码基因以及一经与动物抗体接触在人癌细胞中表达的基因两者都用相同的条形码标记。在该步骤中或在区室内部第一链cDNA合成之后，汇集所有区室的内容物。随后产生下一代测序文库并且对其进行测序。然后，基于条形码分析所得数据，揭示特定区室中存在的抗体的身份以及其对人体细胞的表达模式的影响。这允许特异性地寻找具有所需的功能性作用的抗体，如可以从表达模式推导出，例如特定途径的活化/失活。基于用整个细胞或膜提取物(包括数百或数千个表位)免疫动物，该方法能够针对数百种或甚至数千种作用平行地筛选数百万个抗体。到迄今为止，这种复用(multiplexing)水平尚未在药物发现中实现，并且由本专利技术提供。专利技术概述在第一方面，本专利技术涉及多个微流体区室，其中至少1％的所述区室形成子集，所述子集中的每个区室包含：(i)第一细胞，(ii)一种第二细胞或一种无细胞表达系统，其表达旨在特异性与在所述第一细胞的表面上可接近的分子或其部分特异性结合的多肽配体(iii)一组条形码寡核苷酸，其各自包含所述组特有的条形码序列和能够与mRNA和/或cDNA特异性结合的序列。在第二方面，本专利技术涉及用于产生根据第一方面的多个微流体区室的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将以下引入至微流体系统中：(i)包含多个第一细胞的流体，(ii)包含多个第二细胞或无细胞表达系统的流体，所述多个第二细胞或无细胞表达系统各自表达旨在与在第一细胞的表面上可接近的分子或其部分特异性结合的多肽配体，和(iii)包含条形码寡核苷酸组的流体，其中每组的条形码寡核苷酸包含所述组特有的条形码序列和能够与mRNA和/或cDNA特异性结合的序列，(b)重复将第一细胞、第二细胞或无细胞表达系统及一组条形码寡核苷酸共区室化至微流体区室中，使得多个区室中的所述区室子集的大小为至少1％。在第三方面，本专利技术涉及用于确定细胞的基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供根据第一方面的多个微流体区室，(b)裂解所述区室中包含的所述细胞，(c)将从所述细胞释放的mRNA逆转录为cDNA，(d)扩增所述cDNA，(e)确定所述cDNA的序列并任选地确定所述cDNA的相应量，和(f)选择包含相同条形码序列的序列，其中排除以下序列：-来源于第二细胞或无细胞表达系统的序列，-包含独特条形码序列的序列，所述独特条形码序列在其它序列中不与编码由第二细胞或无细胞表达系统表达的多肽配体的核苷酸序列缔合，-包含独特条形码序列的序列，所述独特条形码序列与编码由第二细胞或无细胞表达系统表达的多于一种多肽配体的核苷酸序列缔合，其中用条形码寡核苷酸作为引物来进行步骤(c)或步骤(d)。优选地，该方法还包括确定哪种多肽配体被包含在与步骤(f)中选定的序列来源的细胞相同的区室中的步骤(g)，其包括从来源于第二细胞或无细胞表达系统的被排除的序列中鉴定编码多肽配体的核酸序列，所述核酸序列与步骤(f)的选定序列的条形码序列缔合。在第四方面，本专利技术涉及第三方面的方法在确定以下影响中的用途：(i)抗体对靶细胞的基因表达的影响，其中通过用所述靶细胞或在其表面上可接近的一种或多种分子或其部分免疫脊椎动物产生所述抗体，或(ii)多肽配体对靶细胞的基因表达的影响，其中所述多肽配体来源于文本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.多个微流体区室，其中至少1％的所述区室形成子集，所述子集中的每个区室包含：(i)第一细胞，(ii)一种第二细胞或一种无细胞表达系统，其表达旨在与在所述第一细胞的表面上可接近的分子或其部分特异性结合的多肽配体，和(iii)一组条形码寡核苷酸，其各自包含所述组特有的条形码序列和能够与mRNA和/或cDNA特异性结合的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.01.14 EP 16151298.31.多个微流体区室，其中至少1％的所述区室形成子集，所述子集中的每个区室包含：(i)第一细胞，(ii)一种第二细胞或一种无细胞表达系统，其表达旨在与在所述第一细胞的表面上可接近的分子或其部分特异性结合的多肽配体，和(iii)一组条形码寡核苷酸，其各自包含所述组特有的条形码序列和能够与mRNA和/或cDNA特异性结合的序列。2.如权利要求1所述的多个微流体区室，其中所述区室子集的大小为至少5或10％。3.如权利要求1-2中任一项所述的多个微流体区室，其中所述第一细胞和所述第二细胞或由所述无细胞表达系统表达的多肽配体来源于不同物种。4.如权利要求1-3中任一项所述的多个微流体区室，其中所述第一细胞的表面上可接近的靶分子是细胞信号转导受体。5.如权利要求1-4中任一项所述的多个微流体区室，其中所述第一细胞是患病细胞、干细胞或多能细胞或其中多能性可由多肽配体诱导的细胞。6.如权利要求1-5中任一项所述的多个微流体区室，其中所述第二细胞是B细胞谱系的非人浆细胞，并且所述多肽配体是由所述浆细胞产生的抗体。7.如权利要求1-5中任一项所述的多个微流体区室，其中所述多肽配体选自：抗体、抗体衍生物和抗体模拟物。8.如权利要求1-7中任一项所述的多个微流体区室，其中所述组的条形码寡核苷酸与珠连接。9.如权利要求1-8中任一项所述的多个微流体区室，其中所述能够与mRNA和/或cDNA特异性结合的序列是能够与mRNA3'聚(A)尾或与基因特异性序列特异性结合的序列。10.如权利要求1-8中任一项所述的多个微流体区室，所述多个区室的子集的区室各自还包含以下中的一种或多种：-细胞裂解剂，-RNA酶抑制剂，-DNA酶，-用于逆转录反应的试剂，和/或-用于治疗所述患病细胞或衍生所述患病细胞的疾病的药物或药物候选物，其中所述患病细胞是所述第一细胞。11.用于产生权利要求1-10中任一项所述的多个微流体区室的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将以下引入至微流体系统...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡红星，萨曼莎·塞亚，克里斯托夫·A·莫滕，
申请(专利权)人：欧洲分子生物学实验室，
类型：发明
国别省市：德国,DE