蛋白A结合多肽、抗EPHA2抗体及其使用方法技术

本公开提供了诸多抗体(例如scFv)，所述抗体包括赋予所述抗体以有用性质的CDR和人构架区。在某些实施方案中，此类性质包括热稳定性(例如解链温度增高)、与金黄色葡萄球菌蛋白A有效结合或二者。在某些方面，所述抗体是特异性地结合至肿瘤相关抗原EphA2的内在化抗体。

Protein A binding peptide, anti EPHA2 antibody and its use method

Many antibodies, such as scFv, are provided in the present disclosure, including CDRs and human frameworks that give the antibodies useful properties. In some implementations, such properties include thermal stability (e.g., increased chain temperature), effective binding with Staphylococcus aureus protein A, or both. In some respects, the antibody is an internalized antibody specifically binding to tumor associated antigen EphA2.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白A结合多肽、抗EPHA2抗体及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年3月16日提交的美国临时申请No.62/309,365和2016年3月16日提交的美国临时申请No.62/309,383和2016年3月16日提交的美国临时申请No.62/309,374的优先权，各美国临时申请以引用的方式整体并入本文。引言癌细胞往往异常表达多种蛋白质，包括表达或过度表达某些细胞表面抗原，例如细胞表面受体。可以采用此类异常表达的蛋白质作为治疗抗体的标靶，而且已经利用对许多癌症上表达的细胞表面受体具有特异性的抗体来开发靶向性免疫治疗剂。许多此类治疗剂(包括抗体-药物缀合物，包括免疫脂质体和免疫毒素)和抗体靶向性核酸递送媒剂需要不仅能结合细胞表面抗原而且在结合后内在化至细胞中的抗体。举例来说，目前使用已经与化学治疗剂缀合的能识别由癌细胞表达的细胞表面受体的抗体来治疗霍奇金氏淋巴瘤(本妥昔单抗(brentuximabvedotin))和转移性乳腺癌(腺苷-曲妥珠单抗美坦辛(ado-trastuzumabemtansine))。因为已知异常表达于若干种癌症中而正被考虑用于治疗靶向的一种细胞表面受体是EphA2。如US9,220,772中所描述，使用多步骤筛选方法来分离抗EphA2scFv抗体，所述多步骤筛选方法包括首先进行一般噬菌体选择以便使用人乳腺癌细胞使抗体内在化，然后针对与表达EphA2细胞外域的酵母的结合进行选择。抗体D2-1A7被鉴定为由表达EphA2的细胞强力内在化的配体阻断性scFv。抗体稳定性是一种允许稳固而且可规模化的抗体制造方法的有用性质。另外，为了促进制造用于治疗用途的抗体，需要抗体能够用亲和力树脂进行提纯。对于大部分治疗抗体，金黄色葡萄球菌蛋白A亲和力色谱是早期重要步骤，因为它可以选择性地而且有效地从复杂溶液如所收集的细胞培养液中结合抗体，从而在单个步骤中便去除>99.5％的产物杂质并且提供显著的病毒清除率。持续需要结合至细胞表面受体且表现出适用于工业生产和医学使用的稳定性以及其他可制造性质的新抗体。本文所公开的新颖工程改造抗体解决了这一需要并且提供了额外的优点。概要本公开提供了诸多抗体(例如scFv)，所述抗体包括赋予所述抗体以有用性质的CDR和人构架区。在某些实施方案中，此类性质包括热稳定性(例如解链温度增高)、与金黄色葡萄球菌蛋白A有效结合或二者。在某些方面，所述抗体是特异性地结合至肿瘤相关抗原EphA2的内在化抗体。本公开提供了热稳定(表现出≥67℃或≥70℃的解链温度)的内在化抗EphA2抗体(Ab)(例如scFv)。还提供了对金黄色葡萄球菌蛋白A表现出实质性结合(例如，达到使负载至金黄色葡萄球菌蛋白A(在下文中，“蛋白A”)树脂上的Ig中有至少50％、60％或70％结合至并且被保留在所述树脂上的程度，例如，使用实施例1的测定法)的Ab(例如scFv)。提供了赋予所期望的蛋白A结合性质的多肽以及含有此类蛋白A结合多肽的抗体(例如scFv)；赋予所期望的蛋白A结合性质的VHCDR2多肽以及含有其的抗体(例如scFv)；提供所期望的热稳定性质的VH和VL构架多肽(包括共有框架区序列)以及具有此类构架序列的抗体(例如scFv)；以及具有此类蛋白A结合多肽、VHCDR2多肽和热稳定性增强构架的组合的Ab(例如scFv)。另外，所公开的Ab表现出对于工业规模脂质体缀合和其他制造方法以及对于治疗用途来说理想的其他性质。因此，公开了针对工业制造和针对医学使用而设计并调整的抗EphA2抗体以及相关缀合物、组合物和使用方法。使用方法涵盖用作脂质体治疗剂的靶向组分以及用作诊断剂和用于筛选方法中。因此，本公开提供了一种抗A型Ephrin受体2(EphA2)抗体，所述抗体包含：VH，所述VH包含：VHCDR1，所述VHCDR1包含氨基酸序列SYAMH(SEQIDNO:17)；VHCDR2，所述VHCDR2包含以下具有17个氨基酸的序列：X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(SEQIDNO:18)，其中：X17是A或V；X18是A、D、H、N、P、S或T；X19是A、R、H、N或P；且X20是K或T；和VHCDR3，所述VHCDR3包含氨基酸序列ASVGATGPFDI(SEQIDNO:19)；以及VL，所述VL包含：VLCDR1，所述VLCDR1包含氨基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQIDNO:20)；VLCDR2，所述VLCDR2包含氨基酸序列GENNRPS(SEQIDNO:21)；和VLCDR3，所述VLCDR3包含氨基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQIDNO:22)；其中所述抗体免疫特异性地结合EphA2的细胞外域。本公开还提供了结合蛋白A的多肽，其中所述多肽包含具有下式的氨基酸序列：a)XaX17ISXbX18GX19NX20(SEQIDNO:198)，其中Xa是S、T或A；X17是A或V；Xb是P、R、N或H；X18和X19是任何氨基酸，并且在一些实施方案中，X18是A、D、H、N、P、S或T；和/或其中X19是A、R、H、N或P；并且X20是K或T；b)XaVISXbX18GX19NX20(SEQIDNO:199)，其中Xa是S或T；Xb是P、R或N；X18是任何氨基酸，并且在一些实施方案中是A、D、H、N、P、S或T；X19是H、N、R、T、A、D、P或S；并且X20是K或T；c)XaVISXbX18GX19NX20(SEQIDNO:200)，其中Xa是S或T；Xb是P、R或N；X18是任何氨基酸，并且在一些实施方案中是A、D、H、N、P、S或T；X19是H、N、R或T；并且X20是T或K；或d)XaX17ISXbX18GX19NX20(SEQIDNO:201)，其中Xa是S或T；X17是V；Xb是P；X18是任何氨基酸，并且在一些实施方案中是A、D、H、N、P、S或T；X19是H、N、R或T，并且在一些实施方案中是A、R、H、N或P；并且X20是T或K。在相关实施方案中，所述蛋白A结合多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:177-197之一。在一些实施方案中，所述蛋白A结合多肽包含：VHCDR1，所述VHCDR1包含氨基酸序列SYAMH(SEQIDNO:17)；蛋白A结合序列，所述蛋白A结合序列包含氨基酸序列SEQIDNO:177至201之一；和VHCDR3，所述VHCDR3包含氨基酸序列ASVGATGPFDI(SEQIDNO:19)。本公开还提供了包含VH和VL的抗体，其中所述VH包含如上文所描述的蛋白A结合多肽。在某些实施方案中，所述抗体包含以下至少一个构架区：(a)人VH构架区1(VHFR1)，所述人VHFR1包含氨基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQIDNO:1)，其中X1是除E以外的氨基酸，和/或(b)人VH构架区2(VHFR2)，所述人VHFR2包含氨基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQIDNO:2)，其中X2是除S以外的氨基酸；或其中所述抗体包含：蛋白A结合多肽，所述蛋白A结合多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:177-201之一；人VH构架区2(VHFR2)，所述人VHFR2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗A型Ephrin受体2(EphA2)抗体，所述抗体包含：VH，所述VH包含：VH CDR1，所述VH CDR1包含氨基酸序列SYAMH(SEQ ID NO:17)；VH CDR2，所述VH CDR2包含以下具有17个氨基酸的氨基酸序列：X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(SEQ ID NO:18)，其中：X17是A或V；X18是A、D、H、N、P、S或T；X19是A、R、H、N或P；并且X20是K或T；和VH CDR3，所述VH CDR3包含氨基酸序列ASVGATGPFDI(SEQ ID NO:19)；以及VL，所述VL包含：VL CDR1，所述VL CDR1包含氨基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO:20)；VL CDR2，所述VL CDR2包含氨基酸序列GENNRPS(SEQ ID NO:21)；和VL CDR3，所述VL CDR3包含氨基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQ ID NO:22)；其中所述抗体免疫特异性地结合EphA2的细胞外域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.16 US 62/309,365;2016.03.16 US 62/309,383;1.一种抗A型Ephrin受体2(EphA2)抗体，所述抗体包含：VH，所述VH包含：VHCDR1，所述VHCDR1包含氨基酸序列SYAMH(SEQIDNO:17)；VHCDR2，所述VHCDR2包含以下具有17个氨基酸的氨基酸序列：X17ISPX18GX19NX20YYADSVKG(SEQIDNO:18)，其中：X17是A或V；X18是A、D、H、N、P、S或T；X19是A、R、H、N或P；并且X20是K或T；和VHCDR3，所述VHCDR3包含氨基酸序列ASVGATGPFDI(SEQIDNO:19)；以及VL，所述VL包含：VLCDR1，所述VLCDR1包含氨基酸序列QGDSLRSYYAS(SEQIDNO:20)；VLCDR2，所述VLCDR2包含氨基酸序列GENNRPS(SEQIDNO:21)；和VLCDR3，所述VLCDR3包含氨基酸序列NSRDSSGTHLTV(SEQIDNO:22)；其中所述抗体免疫特异性地结合EphA2的细胞外域。2.一种结合蛋白A的多肽，其中所述多肽包含以下氨基酸序列：a)XaX17ISXbX18GX19NX20(SEQIDNO:198)，其中Xa是S、T或A；X17是A或V；Xb是P、R、N或H；X18和X19是任何氨基酸；并且X20是K或T；b)XaVISXbX18GX19NX20(SEQIDNO:199)，其中Xa是S或T；Xb是P、R或N；X18是任何氨基酸；X19是H、N、R、T、A、D、P或S；并且X20是K或T；c)XaVISXbX18GX19NX20(SEQIDNO:200)，其中Xa是S或T；Xb是P、R或N；X18是任何氨基酸；X19是H、N、R或T；并且X20是T或K；或d)XaX17ISXbX18GX19NX20(SEQIDNO:201)，其中Xa是S或T；X17是V；Xb是P；X18是任何氨基酸；X19是H、N、R或T；并且X20是T或K。3.如权利要求2所述的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:177-197之一。4.如权利要求2或3所述的多肽，其中所述多肽包含：VHCDR1，所述VHCDR1包含氨基酸序列SYAMH(SEQIDNO:17)；蛋白A结合序列，所述蛋白A结合序列包含氨基酸序列SEQIDNO:177至201之一；和VHCDR3，所述VHCDR3包含氨基酸序列ASVGATGPFDI(SEQIDNO:19)。5.一种抗体，所述抗体包含VH和VL，其中所述VH包含如权利要求2至4中任一项所述的多肽。6.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。7.如权利要求5所述的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。8.如权利要求1或6所述的抗体，其中所述抗体包含至少一个选自由以下各项组成的组的构架区：(a)人VH构架区1(VHFR1)，所述人VHFR1包含氨基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQIDNO:1)，其中X1是除E以外的氨基酸；(b)人VH构架区2(VHFR2)，所述人VHFR2包含氨基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQIDNO:2)，其中X2是除S以外的氨基酸；(c)人VL构架区1(VLFR1)，所述人VLFR1包含氨基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQIDNO:3)，其中：X3是除Q以外的氨基酸，X4是除V以外的氨基酸，X5是除G以外的氨基酸，X6是除R以外的氨基酸，并且X7是除S以外的氨基酸；(d)人VL构架区1(VLFR1)，所述人VLFR1包含氨基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQIDNO:4)，其中：X8是除Q以外的氨基酸，或X9是除S以外的氨基酸；(e)人VL构架区2(VLFR2)，所述人VLFR2包含氨基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQIDNO:5)，其中X10是除L以外的氨基酸；和(f)人VL构架区3(VLFR3)，所述人VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQIDNO:6)，其中：X11是除F以外的氨基酸，X12是除K以外的氨基酸，X13是除A以外的氨基酸，或X14是除L以外的氨基酸；和(g)人VL构架区3(VLFR3)，所述人VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQIDNO:7)，其中：X15是除F以外的氨基酸，或者X16是除K以外的氨基酸。9.如权利要求5或7所述的抗体，其中所述抗体包含至少一个选自由以下各项组成的组的构架区：(a)人VH构架区1(VHFR1)，所述人VHFR1包含氨基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQIDNO:1)，其中X1是除E以外的氨基酸；(b)人VH构架区2(VHFR2)，所述人VHFR2包含氨基酸序列WVRQAPGKGLEWV(SEQIDNO:202)；(c)人VL构架区1(VLFR1)，所述人VLFR1包含氨基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQIDNO:3)，其中：X3是除Q以外的氨基酸，X4是除V以外的氨基酸，X5是除G以外的氨基酸，X6是除R以外的氨基酸，并且X7是除S以外的氨基酸；(d)人VL构架区1(VLFR1)，所述人VLFR1包含氨基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQIDNO:4)，其中：X8是除Q以外的氨基酸，或X9是除S以外的氨基酸；(e)人VL构架区2(VLFR2)，所述人VLFR2包含氨基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQIDNO:5)，其中X10是除L以外的氨基酸；和(f)人VL构架区3(VLFR3)，所述人VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQIDNO:6)，其中：X11是除F以外的氨基酸，X12是除K以外的氨基酸，X13是除A以外的氨基酸，或者X14是除L以外的氨基酸；和(g)人VL构架区3(VLFR3)，所述人VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQIDNO:7)，其中：X15是除F以外的氨基酸，或者X16是除K以外的氨基酸。10.如权利要求1和5至7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VHFR1，所述VHFR1包含氨基酸序列QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQIDNO:8)。11.如权利要求1和6中任一项所述的抗体，其中所述VHFR2包含氨基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQIDNO:9)或WVRQAPGKGLEWVT(SEQIDNO:10)。12.如权利要求1和5至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VLFR1，所述VLFR1包含氨基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQIDNO:3)，并且其中X3是除Q以外的氨基酸，X4是除V以外的氨基酸，X5是除G以外的氨基酸，X6是除R以外的氨基酸，并且X7是除S以外的氨基酸。13.如权利要求1和5至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VLFR1，所述VLFR1包含氨基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQIDNO:3)，并且其中X3是S，X4是E，X5是V，X6是T，并且X7是T。14.如权利要求1和5至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VLFR1，所述VLFR1包含氨基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQIDNO:4)，并且其中X8是除Q以外的氨基酸，并且X9是除S以外的氨基酸。15.如权利要求1和5至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VLFR1，所述VLFR1包含氨基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQIDNO:4)，并且其中X8是S或者X9是T。16.如权利要求1和5至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VLFR1，所述VLFR1包含氨基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQIDNO:4)，并且其中X8是S，并且X9是T。17.如权利要求1和5至16中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VLFR2，所述VLFR2包含氨基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQIDNO:5)，并且其中X10是除L以外的氨基酸。18.如权利要求1和5至16中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VLFR2，所述VLFR2包含氨基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQIDNO:5)，并且其中X10是K。19.如权利要求1和5至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VLFR3，所述VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQIDNO:6)，并且其中X11是除F以外的氨基酸，X12是除K以外的氨基酸，X13是除A以外的氨基酸，并且X14是除L以外的氨基酸。20.如权利要求1和5至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VLFR3，所述VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQIDNO:6)，并且其中X11是S，X12是S，X13是T，或者X14是A。21.如权利要求1和5至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VL构架区3(VLFR3)，所述VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQIDNO:7)，其中：X15是除F以外的氨基酸，并且X16是除K以外的氨基酸。22.如权利要求1和5至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VLFR3，所述VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQIDNO:7)，其中：X15是S或X16是G。23.如权利要求1和5至18中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含VL构架区3(VLFR3)，所述VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQIDNO:7)，其中：X15是S，并且X16是G。24.如权利要求1或6所述的抗体，其包含：VH构架区1(VHFR1)，所述VHFR1包含氨基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQIDNO:1)，其中X1是除E以外的氨基酸；VH构架区2(VHFR2)，所述VHFR2包含氨基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQIDNO:2)，其中X2是除S以外的氨基酸；VL构架区1(VLFR1)，所述VLFR1包含氨基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQIDNO:3)，其中X3是除Q以外的氨基酸，X4是除V以外的氨基酸，X5是除G以外的氨基酸，X6是除R以外的氨基酸，并且X7是除S以外的氨基酸；VL构架区2(VLFR2)，所述VLFR2包含氨基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQIDNO:5)，其中X10是除L以外的氨基酸；和VL构架区3(VLFR3)，所述VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX11X12SGTSASLX13ITGX14QAEDEADYYC(SEQIDNO:6)，其中X11是除F以外的氨基酸，X12是除K以外的氨基酸，X13是除A以外的氨基酸，并且X14是除L以外的氨基酸。25.如权利要求1、6或24所述的抗体，所述抗体包含：VH构架区1(VHFR1)，所述VHFR1包含氨基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQIDNO:1)，其中X1是除E以外的氨基酸；VH构架区2(VHFR2)，所述VHFR2包含氨基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQIDNO:2)，其中X2是除S以外的氨基酸；VL构架区1(VLFR1)，所述VLFR1包含氨基酸序列X8SVLTQPPSVSGAPGQRVTIX9C(SEQIDNO:4)，其中：X8是除Q以外的氨基酸，或X9是除S以外的氨基酸；和VL构架区3(VLFR3)，所述VLFR3包含氨基酸序列GVPDRFSGX15X16SGTSASLAITGLQAEDEADYYC(SEQIDNO:7)，其中：X15是除F以外的氨基酸，并且X16是除K以外的氨基酸。26.如权利要求5或7所述的抗体，所述抗体包含：VH构架区1(VHFR1)，所述VHFR1包含氨基酸序列QVQLVX1SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQIDNO:1)，其中X1是除E以外的氨基酸；VH构架区2(VHFR2)，所述VHFR2包含氨基酸序列WVRQAPGKGLEWVX2(SEQIDNO:2)，其中X2是除S以外的氨基酸；VL构架区1(VLFR1)，所述VLFR1包含氨基酸序列X3SX4LTQPPSVSX5APGQX6VTIX7C(SEQIDNO:3)，其中X3是除Q以外的氨基酸，X4是除V以外的氨基酸，X5是除G以外的氨基酸，X6是除R以外的氨基酸，并且X7是除S以外的氨基酸；VL构架区2(VLFR2)，所述VLFR2包含氨基酸序列WYQQX10PGTAPKLLIY(SEQIDNO:5)，其中X10是除L以外的氨基酸；和VL构架区3(VLFR3)，所述VLFR3包含氨基酸序列G...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·D·马克斯，D·德拉蒙德，M·格迪，D·柯波廷，N·克里，A·卢格维斯凯，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，梅里马克制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US