一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒及其制作和使用方法技术

技术编号:19387937 阅读:18 留言:0更新日期:2018-11-10 01:41
本发明专利技术公开了一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒及其制作和使用方法。采用本发明专利技术的二抗竞争免疫比浊方法,从免疫反应的原理上克服了现有的增强免疫比浊方法的缺陷,当测量反应体系中无抗原时,连接在胶乳粒子上的二抗将和体系中的一抗产生凝集反应,且这种凝集效果达到最大;当测量反应体系中有抗原存在时,抗原将与一抗结合,形成抗原‑抗体(一抗)免疫复合物,这种结合,将封闭一抗与二抗的结合位点,并与一抗、二抗免疫凝集反应形成竞争,若限定一抗的量,样品中抗原将竞争性抑制一抗‑二抗免疫复合物的凝集效果,因此,随反应体系中游离抗原量增加,一抗与二抗‑胶乳反应形成免疫复合物的凝集效果反而会下降。

Human urine albumin latex enhanced two anti competitive immune turbidimetric detection kit and its making and using method

The invention discloses a human urinary albumin latex enhanced competitive immune turbidimetric test kit and its preparation and use method. The second anti-competitive immune turbidimetric method of the invention overcomes the defects of the existing enhanced immune turbidimetric method from the principle of immune response. When there is no antigen in the measurement reaction system, the second anti-body connected to the latex particles will produce agglutination reaction with the first anti-body in the system, and the agglutination effect reaches the maximum when the measurement of the anti-body is carried out. When there are antigens in the system, the antigen will bind with the first antibody to form an antigen-antibody (first antibody) immune complex. This binding will close the binding sites of the first antibody and the second antibody, and compete with the first antibody and the second antibody immune agglutination reaction. If the quantity of the first antibody is limited, the antigen in the sample will competently inhibit the first antibody and the second antibody immunity. Therefore, the agglutination effect of immune complex formed by the reaction of primary antibody and secondary antibody latex will decrease with the increase of free antigen in the reaction system.

【技术实现步骤摘要】
一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒及其制作和使用方法
本专利属于生物
,尤其涉及一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒及其制作和使用方法。
技术介绍
免疫比浊分析方法在临床得到普遍开展,有几十种试剂盒已在临床应用,同时新的生物标记物的发现,将不断推进这种新的试剂盒产生。目前主要有两种类型,一种是直接将抗体加入反应体系中,在一定的条件下,抗原、抗体反应形成免疫复合物,产生凝集或沉淀使体系浊度改变,这种浊度变化与体系中抗原浓度具有正向的相关关系,据此可以测定样品中抗原浓度,这种方法通常称为比浊或普通比浊;第二种是在第一种方法基础上发展而来,将抗体结合到固态微粒上,可以增强凝集或沉淀的效果,以提高分析灵敏度,这种方法通常称为增强免疫比浊。增强免疫比浊这种均相的免疫分析过程中,维持抗原、抗体适当的比例十分重要,否则当抗原过量时,抗原-抗体免疫复合物产生沉淀或凝集的效果反而会降低,这就是免疫比浊分析中,通常所说的“钩状效应”,由于“钩状效应”存在,过量抗原检测时,免疫复合物形成沉淀的效果反而下降,会测出较低的浓度值,得出“假阴性”结果,这种假阴性结果往往会引起临床误判。尿微量白蛋白是反映肾小球疾病和肾损伤的一个非常灵敏的指标。尤其在糖尿病、高血压等疾病发生的早期用于了解肾脏的损伤情况有特殊的意义,正常状态下,人尿液中白蛋白的含量低于20mg/L,当有肾损伤时,微量白蛋白可高达1000mg/L甚至更高。尿中白蛋白检测时,需要考虑过量抗原检测所产生的假阴性结对临床的误判,避免由于抗原过量时的假阴性结果,有人利用预反应阀值判断的方法,用于过量抗原测定,通过短时间预反应,给定浊度变化的阀值,筛选出抗原过量的样本,稀释后再测定,采用这种方法可以有效的避免“假阴性”结果,但对于不同的分析物质,由于抗体不同,给定的阀值各有所不同,另外,不同批次的抗原抗体质量不完全相同,也影响阀值的设定,除此以外,这种方法不同于常规的免疫分析过程,需要设计专用测定程序或专用设备,无法在一般自动生化分析仪上实现这种分析过程。此外比较有效的方法是利用定性的方法,预测样本中的白蛋白浓度,如使用尿蛋白试纸预测,筛选出高浓度样本,将高值样本稀释后再测定,这种方法实际需要两次测定,会产生多余诊断费用,也给临床诊断实验室增加多余的工作量。上述免疫比浊方法存在的问题主要如下:1.现有的胶乳增强尿微量白蛋白免疫比浊检测方法,以抗体联结胶乳,设计成所谓正向免疫比浊试剂盒用于临床检测,这种方法的检测范围通常在0-100ug/L,当样品浓度超过100ug/L时,其测定结果有可能因为“钩状效应”而出现假阴性。2.现有的免疫比浊方法,通常以抗体联结胶乳,设计成所谓正向免疫比浊试剂盒用于临床检测,针对不同分析物,需要制备不同种类抗体胶乳联结物,胶乳-抗体联结物的质量是试剂盒产品质量的关键因素,胶乳-抗体联结物的质量受胶乳自身性质、抗体性质及联结方法等。胶乳自身性质包括胶乳材料及合成方法,胶乳颗粒大小,胶乳表面性状等;抗体性质包括抗体种类、抗原决定族和抗体纯度等;联结方法包括物理方法和化学方法,物理吸附联结方法受粒子表面性状,大小及抗体纯度及吸附过程影响,而化学方法受粒子表面活性基团,交联剂、联结过程等影响。以上居多因素影响,同时由于抗体蛋白和胶乳颗粒的多样性,即使是同一胶乳和抗体,无任是采用物理方法还是化学方法,不同生产商,由于不同胶乳-抗体联结物制备方法不完全一致,都无法获得完全相同试剂盒产品。导致临床结果受试剂盒产品因素影响而难以标准化,以至于不同医院对同一检测结果无法通用,造成多次检测的现象,增加患者的检测费用。3.现有的免疫比浊方法,对于每一种分析物,需要制备对应的一种胶乳-抗体联结物,其试剂盒的研发过程需要对抗体种类,胶乳种类,胶乳大小及联结方法进行研究获得最佳的检测方案,制备出试剂盒;生物技术日新月异,临床上有价值的新标识物不断被发现,需要开发的新试剂盒不断增加,这为试剂盒开发增加了巨大的工作量。
技术实现思路
为解决上述问题,本专利技术公开了一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒及其制作和方法。如图4所示,采用本专利技术的增强免疫抑制比浊方法,从免疫反应的原理上克服了现有的增强免疫比浊方法的缺陷,其所利用的就是免疫反应凝集的过量抗原曲线部分,当测量反应体系中无抗原时,连接在胶乳粒子上的二抗(Ab2)将和体系中的第一抗体(Ab1,抗人白蛋抗体)产生凝集反应,形成胶乳凝集物,在一定的抗体浓度条件下,这种凝集效果将达到最大,当测量反应体系中有抗原存在时,抗原将与第一抗体反应,形成可溶性免疫复合物,由于大分子的空间位阻效应,抗原将封闭第一抗体上的二抗结合位点,并形成一种竞争性的抑制效果,样品中抗原将竞争性抑制一抗-二抗免疫复合物的凝集效果,因此,随反应体系中游离抗原量增加,一抗与二抗-胶乳反应形成免疫复合物的凝集效果反而会下降,当测量体系中抗原达到一定量时,游离抗原趋向于完全抑制一抗-二抗反应的凝集效果,如果能克服胶乳和样品中其他物质的非特异性结合,反应过程浊度变化将趋向于为零。尽管这种方法无法将高浓度范围无限扩展,但不会出现假阴性的检测结果,还将有效的筛选出过线的高浓度白蛋白样本,当确有需要时,可以稀释高浓度样本,再次测定以得到准确结果。为实现上述目的,本专利技术的技术方案为:一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒,包括试剂1和试剂2;所述试剂1包括负载物,所述负载物上负载有待使用一抗的抗体,即二抗;所述二抗为兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG;所述试剂2包括待使用一抗,所述待使用一抗为鼠抗人白蛋白单克隆抗体或兔抗人白蛋白多克隆抗体。进一步的改进,所述负载物为胶乳粒子。进一步的改进,所述胶乳粒子为羧基纳米胶乳粒子。进一步的改进,所述羧基纳米胶乳粒子的径粒范围为40-500纳米。进一步的改进,分别制备试剂1和试剂2,具体包括如下步骤:试剂1:取纳米胶乳粒子溶液,用酸性缓冲液稀释后,加入活化剂活化,再加入待使用抗体的二抗进行连接反应,待连接反应结束后加入封闭剂、防腐剂、表面活性剂,然后用中性缓冲液稀释到工作体积,即制备得到含有二抗-胶乳的试剂1;试剂2:在中性缓冲液中加入无机盐,防腐剂、表面活性剂,过滤得到稀释液,用稀释液稀释待使用一抗到工作浓度,即制备得到试剂。进一步的改进,所述封闭剂为甘氨酸、防腐剂为Proclin300、表面活性剂为Tween20;所述酸性缓冲液和中性缓冲液均为磷酸缓冲液;无机盐为NaCl;所述乳胶粒子为羧基纳米胶乳粒子,活化剂为二环己基碳二亚胺,二抗为兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG。进一步的改进,试剂1和试剂2的最终试剂配方中各成分的质量体积比如下:试剂1和试剂2的最终试剂配方中各成分的质量体积比如下:试剂1:PH7.0,0.02M/L磷酸缓冲液二抗-胶乳0.01-0.05%g/L甘氨酸0.002M/LTween200.01%g/LProclin3000.1%g/L试剂2:PH7.5,0.02M/L磷酸缓冲液一抗按工作浓度稀释甘氨酸0.002M/LNaCl0.15M/LTween200.001%g/LProclin3000.1%。g/L。进一步的改进,包括如下步骤:试剂1制备:取粒径100nm,10%浓度本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒,其特征在于,包括试剂1和试剂2;所述试剂1包括负载物,所述负载物上负载有待使用一抗的抗体,即二抗;所述二抗为兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG;所述试剂2包括待使用一抗,所述待使用一抗为鼠抗人白蛋白单克隆抗体或兔抗人白蛋白多克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒,其特征在于,包括试剂1和试剂2;所述试剂1包括负载物,所述负载物上负载有待使用一抗的抗体,即二抗;所述二抗为兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG;所述试剂2包括待使用一抗,所述待使用一抗为鼠抗人白蛋白单克隆抗体或兔抗人白蛋白多克隆抗体。2.如权利要求1所述的人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒,其特征在于,所述负载物为胶乳粒子。3.如权利要求2所述的人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒,其特征在于,所述胶乳粒子为羧基纳米胶乳粒子。4.如权利要求3所述的人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒,其特征在于,所述羧基纳米胶乳粒子的径粒范围为40-500纳米。5.一种人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒的制作方法,其特征在于,分别制备试剂1和试剂2,具体包括如下步骤:试剂1:取纳米胶乳粒子溶液,用酸性缓冲液稀释后,加入活化剂活化,再加入待使用抗体的二抗进行连接反应,待连接反应结束后加入封闭剂、防腐剂、表面活性剂,然后用中性缓冲液稀释到工作体积,即制备得到含有二抗-胶乳的试剂1;试剂2:在中性缓冲液中加入无机盐,防腐剂、表面活性剂,过滤得到稀释液,用稀释液稀释待使用一抗到工作浓度,即制备得到试剂。6.如权利要求5所述的人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒的制作方法,其特征在于,所述封闭剂为甘氨酸、防腐剂为Proclin300、表面活性剂为Tween20;所述酸性缓冲液和中性缓冲液均为磷酸缓冲液;无机盐为NaCl;所述乳胶粒子为羧基纳米胶乳粒子,活化剂为二环己基碳二亚胺,二抗为兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG。7.如权利要求6所述的人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒的制作方法,其特征在于,试剂1和试剂2的最终试剂配方中各成分的质量体积比如下:试剂1:PH7.0,0.02M/L磷酸缓冲液二抗-胶乳0.01-0.05%g/L甘氨酸0.002M/LTween200.01%g/LProclin3000.1%g/L试剂2:PH7.5,0.02M/L磷酸缓冲液一抗按工作浓度稀释甘氨酸0.002M/LNaCl0.15M/LTween200.001%g/LProclin3000.1%g/L。8.权利要求5所述的人尿白蛋白胶乳增强二抗竞争免疫比浊检测试剂盒的制作方法,其特征在于,包括如下步骤:试剂1制备:取粒径100nm,10%浓度的羧基纳米胶乳粒子0.2ml,加入PH4.6,0.02M磷酸缓冲液0.8ml,加入20ul浓度为20mg/ml的二环己基碳二亚胺,37℃摇床保温反应20分钟活化后,加入...

【专利技术属性】
技术研发人员:文建新刘株漆乐新
申请(专利权)人:长沙文瀚生物技术有限责任公司
类型:发明
国别省市:湖南,43

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1