一种玉米赤霉烯酮定量快速检测卡及其检测方法和制备方法技术

本发明专利技术公开了一种玉米赤霉烯酮定量快速检测卡及其制备方法，包括依次粘贴设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上具有包被有ZEA半抗原‑载体蛋白偶联剂的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线，待检样本溶液在滴加到所述样品垫前与偶联有ZEA抗体的乳胶微球进行混合、孵育处理；其检测方法包括预热、加液、孵育、反应和读取结果；本发明专利技术所述检测卡无需含金标抗体的释放垫，用于与检测样本溶液混合的偶联有ZEA抗体的乳胶微球，颜色鲜艳易判别，且偶联抗体为化学键偶合，比胶体金物理吸附稳定性好，检测准确度和精密度高；批次间差异性小成本低；另外，本发明专利技术所述检测卡的检测方法操作简易，适于批量化生产和应用。

Zearalenone quantitative rapid detection card and its detection method and preparation method

The invention discloses a rapid quantitative detection card for zearalenone and a preparation method thereof, which comprises a sample pad, a nitrocellulose membrane and a water absorbent pad which are successively pasted on the bottom plate. The nitrocellulose membrane has a detection line coated with ZEA hapten carrier protein coupling agent and a quality control line coated with sheep anti-mouse antibody. The sample solution to be tested is mixed and incubated with latex microspheres coupled with ZEA antibody before dropping onto the sample pad; the detection method includes preheating, adding liquid, incubating, reaction and reading results; the detection card of the invention does not need a release pad containing gold label antibody, and is used for coupling with the sample solution to be mixed with ZEA antibody. The latex microsphere of the antibody is bright and easy to distinguish, and the conjugated antibody is chemically bonded, which has better physical adsorption stability, higher detection accuracy and precision than the colloidal gold; the difference between batches is small and the cost is low; moreover, the detection method of the detection card of the invention is simple and easy to operate, and is suitable for batch production and application.

【技术实现步骤摘要】
一种玉米赤霉烯酮定量快速检测卡及其检测方法和制备方法
本专利技术是涉及一种玉米赤霉烯酮定量快速检测卡及其检测方法和制备方法，属于生物检测
，特别适用于粮油和谷物类的玉米赤霉烯酮的定量快速检测。
技术介绍
玉米赤霉烯酮又称F-2毒素，它首先从有赤霉病的玉米中分离得到。玉米赤霉烯酮其产毒菌主要是镰刀菌属的菌侏，如禾谷镰刀菌和三线镰刀菌。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物。其中玉米的阳性检出率为45％，最高含毒量可达到2909mg/kg；小麦的检出率为20％，含毒量为0.364～11.05mg/kg。玉米赤霉烯酮的耐热性较强，110℃下处理1h才被完全破坏。玉米赤霉烯酮具有雌激素作用，主要作用于生殖系统，可使家畜，家禽和实验小鼠产生雌性激素亢进症。妊娠期的动物(包括人)食用含玉米赤霉烯酮的食物可引起流产，死胎和畸胎。食用含赤霉病麦面粉制作的各种面食也可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心、发冷、头痛、神智抑郁和共济失调等。玉米赤霉烯酮属于霉菌毒素的一种，我国国家标准GB2761-2017食品安全国家标准食品中真菌毒素国家限量玉米赤霉烯酮限量60ppb，目前粮油和谷物领域流行的霉菌毒素试纸条主要为胶体金定性产品，胶体金定量产品由于准确度、精密度和稳定性很难达到要求，一直难以占市场主导，客户只能靠酶联免疫试剂盒和仪器法如高效液相等，检测样品的具体含量，酶联免疫试剂盒和仪器法对人员和环境的要求较高，检测时间较长；并且现有技术还存在下述缺陷和不足：(1)胶体金本身为暗紫红色，颜色较浅，不易判别检测结果的阴阳性；(2)胶体金一批制金量最多约10L左右，粒径偏差较难精准控制，大量生产定量产品，不同批容易造成大的批间差，进而影响检测结果的精度和结果稳定性；(3)胶体金标记技术为物理吸附，较化学键偶联，产品稳定性较差；(4)目前市场胶体金试纸条主要为定性产品，不能满足人们对操作快速、简单、人员要求低、成本低、肉眼可视的定量产品的应用需求，且现有定性筛选，假阴性和假阳性较高；(5)烧金、标记抗体工作量较大，工艺繁琐，产出少，浪费人力物力。不仅如此，由于ZEA抗体和抗原的特殊性，胶体金标记ZEA技术的变异系数较大，影响检测精度；如王桂芳等人采用胶体金测试条法快速定量测定粮食中的玉米赤霉烯酮，并与液相色谱法相比较(胶体金测试条法对粮食中玉米赤霉烯酮快速定量测定的应用研究，王桂芳、李培真、曹阳、郭健、刘美辰，《粮食科技与经济》2014年2月第39卷第1期)，虽然验证了此方法在检测粮食中玉米赤霉烯酮的实用性，但是其检测结果中小麦的变异系数(RSD或CV值)为12.4-32.6，玉米的变异系数(RSD或CV值)为11.0-15.1，明显其变异系数较大，测定准确度偏低。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题和需求，本专利技术的目的是提供一种玉米赤霉烯酮定量快速检测卡及其检测方法，将待检测样液提前与乳胶微球混合制得含ZEA抗体的反应液后再滴加到检测卡上进行检测，提高了检测结果的准确度和稳定性，解决了变异系数大的问题，操作和制作简单，成本低廉，适于大批量产出和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种玉米赤霉烯酮定量快速检测卡，其特征在于：包括依次设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上具有包被有玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线，待检样本溶液在滴加到所述样品垫之前与偶联有ZEA抗体的乳胶微球进行混合、孵育处理，在制备所述玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂时，先制得ZEAO粗提物，在对得到的ZEAO粗提物进行展开和洗脱，制得ZEAO，再将制得ZEAO活化后逐滴加到cBSA溶液中，搅拌反应后，再用超纯水4℃透析72小时，最后于-20℃条件下保存备用完成制备。作为优选方案，所述检测线和所述质控线的包被量分别为0.1mg/mL和0.2mg/mL。作为进一步优选方案，所述硝酸纤维素膜在完成所述检测线和所述质控线的包被后，在37℃条件先进行烘干过夜处理。作为优选方案，所述样品垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫依次粘贴固定在所述底板上，所述样品垫和所述吸水垫分别与所述硝酸纤维素膜搭接。作为进一步优选方案，所述样品垫、所述硝酸纤维素膜、所述吸水垫、所述检测线和所述质控线沿所述底板长度方向的的长度依次为25mm、21mm、20mm、3-4mm和3-4mm，所述样品垫和所述吸水垫分别与所述硝酸纤维素膜的搭接宽度为1-2mm。本专利技术还提供一种上述玉米赤霉烯酮定量快速检测卡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：制备偶联有ZEA抗体的乳胶微球，并将其冻干包被储存备用；步骤二：将玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂包被于硝酸纤维素膜以形成检测线，将羊抗鼠抗体包被于硝酸纤维素膜以形成质控线；步骤三：将所述样品垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫依次粘贴固定在所述底板上。作为优选方案，所述玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂的通过下述方法制备获得：先将玉米赤霉烯酮半抗原溶解于DMF中，再加入EDC，然后将制得的溶液在室温下搅拌24小时后，逐滴缓慢滴加到溶解有OVA的CB溶液中，并于室温下搅拌24小时，最后将得到的溶液用PBS透析3天。作为进一步优选方案，所述玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂通过下述方法制备获得：先取2mg玉米赤霉烯酮半抗原溶解于200μL无水吡啶中，再加入4mg羧甲基羟胺半盐酸盐，于室温条件下震荡反应24小时后，进行真空干燥处理，将真空干燥处理后的残留物溶于100μL的HCl中调至pH为3.0，然后沉淀水相中的反应产物，并用乙酸乙酯萃取5次，收集萃取后的乙酸乙酯，再进行抽真空干燥处理，即得到ZEAO的粗提物；将上述得到ZEAO的粗提物溶于1mL甲醇中，并以体积比乙醚：乙酸乙酯＝3:2为展开剂，对ZEAO的粗提物进行薄层层析展开，再用甲醇洗脱上述展开物中含ZEAO的硅胶，在收集甲醇并抽真空干燥处理后即得到ZEAO；将上述得到的ZEAO取1μmol溶解于100μL的二甲基甲酰胺中，再加入2μmol的NHS和1μmol的EDC，在室温条件下震荡反应12小时，即得到ZEAO的活化产物；取2.7mgc的BSA溶于300μL浓度为0.05mol/L的NaHCO3溶液中，将上述ZEAO活化产物逐滴加到cBSA溶液中，边加边搅拌，并在室温条件下搅拌反应24小时，即得到ZEAO偶联产物；将得到的ZEAO偶联产物用超纯水4℃透析72小时，于-20℃条件下保存备用，即得到所述玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂。作为优选方案，所述偶联有ZEA抗体的乳胶微球通过下述方法制备获得：S1：在乳胶微球中加入25mM、pH6.0的MES缓冲溶液，混匀后利用MES缓冲溶液进行离心洗涤；S2：以1L乳胶微球对应40μL的NHS和40μL的EDC的比例分别加入25mM的NHS和EDC反应液，混匀后进行孵育10min处理；S3：利用MES缓冲溶液进行离心洗涤、去上清液处理；S4：加入ZEA抗体至其终浓度为0.6mg/mL后混匀；反应2h；S5：进行离心去除上清处理，并加入2％的BSA进行封闭,再次混匀；在反应1h后进行离心去除上清处理，之后，加入2％的BSA进行清洗、混匀；S6：进行离心去除上清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玉米赤霉烯酮定量快速检测卡，其特征在于：包括依次设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上具有包被有玉米赤霉烯酮半抗原‑载体蛋白偶联剂的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线，待检样本溶液在滴加到所述样品垫之前与偶联有ZEA抗体的乳胶微球进行混合、孵育处理。

【技术特征摘要】
1.一种玉米赤霉烯酮定量快速检测卡，其特征在于：包括依次设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上具有包被有玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线，待检样本溶液在滴加到所述样品垫之前与偶联有ZEA抗体的乳胶微球进行混合、孵育处理。2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于：所述检测线和所述质控线的包被量分别为0.1mg/mL和0.2mg/mL。3.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于：所述样品垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫依次粘贴固定在所述底板上，所述样品垫和所述吸水垫分别与所述硝酸纤维素膜搭接。4.一种权利要求1所述玉米赤霉烯酮定量快速检测卡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：制备偶联有ZEA抗体的乳胶微球，并将其冻干包被储存备用；步骤二：将玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂包被于硝酸纤维素膜以形成检测线，将羊抗鼠抗体包被于硝酸纤维素膜以形成质控线；步骤三：将所述样品垫、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫依次粘贴固定在所述底板上。5.根据权利要求4所述的检测卡的制备方法，其特征在于：所述玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂通过下述方法制备获得：先取2mg玉米赤霉烯酮半抗原溶解于200μL无水吡啶中，再加入4mg羧甲基羟胺半盐酸盐，于室温条件下震荡反应24小时后，进行真空干燥处理，将真空干燥处理后的残留物溶于100μL的HCl中调至pH为3.0，然后沉淀水相中的反应产物，并用乙酸乙酯萃取5次，收集萃取后的乙酸乙酯，再进行抽真空干燥处理，即得到ZEAO的粗提物；将上述得到ZEAO的粗提物溶于1mL甲醇中，并以体积比乙醚：乙酸乙酯＝3:2为展开剂，对ZEAO的粗提物进行薄层层析展开，再用甲醇洗脱上述展开物中含ZEAO的硅胶，在收集甲醇并抽真空干燥处理后即得到ZEAO；将上述得到的ZEAO取1μmol溶解于100μL的二甲基甲酰胺中，再加入2μmol的NHS和1μmol的EDC，在室温条件下震荡反应12小时，即得到ZEAO的活化产物；取2.7mgc的BSA溶于300μL浓度为0.05mol/L的NaHCO3溶液中，将上述ZEAO活化产物逐滴加到cBSA溶液中，边加边搅拌，并在室温条件下搅拌反应24小时，即得到ZEAO偶联产物；将得到的ZEAO偶联产物用超纯水4℃透析72小时，于-20℃条件下保存备用，即得到所述玉米赤霉烯酮半抗原-载体蛋白偶联剂。6.根据权利要求4所述的检测卡的制备方法，其特征在于：所述偶联有ZEA抗体的乳胶微球通过下述方法制备获得：S1：在乳胶微球中加入25mM、pH6.0的MES缓冲溶液，混匀后利用MES缓冲溶液进行离心洗涤；S2：以1L乳胶微球对应40μL的NHS和40μL的EDC的比例分别加入25mM的NHS和EDC反应液，混匀后进行孵育10min处理；S3：利用MES缓冲溶液进行离心洗涤、去上清液处理；S4：加入ZEA抗体至其终浓度为0.6mg/mL后混匀；反应2h；S5：进行离心去除上清处理，并加入2％的BSA进行封闭,再次混匀；在反应1h后进行离心去除上清处理，之后，加入2％的BSA进行清洗、混匀；S6：进行离心去除上清处理，乳胶微球悬浮于储存10mMpH7.0PBS缓冲溶液中，混匀并保存于储存温度为2-8℃的冰箱中备用，即得到偶联抗体；S7：取上述制得的偶联抗体用冻干稀释液稀释后，进行冻干处理，将偶联抗体冻干于乳胶微球的微孔中形成反应微孔，即完成所述偶联抗体的冻干与包被，得到偶联有ZEA抗体的乳胶微球。7.根据权利要求6所述的检测卡的制备方法，其特征在于：所述2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建龙，吴文娟，王俞丹，
申请(专利权)人：河北伊莱莎生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13