本发明专利技术公开了一种快速检测细交链格孢酮酸的免疫层析试纸条，其是利用结构如式(I)所示的半抗原制备的免疫层析试纸条，本发明专利技术采用一步间接竞争免疫层析技术开发出可快速定性或半定量检测样品中TeA含量的免疫层析试纸条，操作简单，经济实用，适合于现场检测，可广泛应用于农产品和食品等样品中TeA污染的检测及快速筛查。
An immunochromatographic strip for rapid detection of fine cross linked pyruvic acid
The present invention discloses an immunochromatographic test strip for rapid detection of fine-crossed aldosterone acid. The immunochromatographic test strip is prepared by using the hapten shown in formula (I). The immunochromatographic test strip for rapid qualitative or semi-quantitative detection of TeA content in samples is developed by one-step indirect competitive immunochromatography technology. It is easy to operate, economical and practical, and suitable for on-site detection. It can be widely used in the detection and rapid screening of TeA contamination in agricultural products and food samples.
【技术实现步骤摘要】
一种快速检测细交链格孢酮酸的免疫层析试纸条
本专利技术涉及食品安全监测和免疫分析检测
，具体地说，一种快速检测细交链格孢酮酸的免疫层析试纸条。
技术介绍
细交链格孢酮酸(Tenuazonicacid,TeA)是目前检出率最高的一种交链孢毒素，也是交链孢菌培养物导致动物急性中毒死亡的主要毒素，有催吐及心血管毒两种基本毒性，可使动物表现多涎、呕吐、厌食、血液浓缩，造成循环系统损伤和出血性胃肠病，从而致动物死亡。TeA的毒性作用主要是抑制蛋白质的生物合成。小鼠TeA持续暴露，发现小鼠出现了比较典型的癌变前的现象：食管黏膜上皮细胞部分细胞的细胞核固缩，染色质增大并呈颗粒化，说明其有诱发食管癌的可能性。且TeA与其他交链孢毒素同时存在时，会产生协同效应使毒性作用增强，进而增强对人和动物的健康风险。TeA在小麦、番茄、葡萄及其制品中检出率较高，特别是小麦及其制品中，在某些地区TeA的污染水平高达1000μg/kg以上。据报道，随膳食摄入TeA毒素对公众健康存在潜在风险，特别是对我国2～6岁儿童风险较大。我国已于2017年将小麦及面粉中交链孢毒素污染列入国家食品污染物及有害因素的监控计划。目前，TeA的检测主要采用传统的大型仪器检测方法，如液相色谱法、液相色谱-质谱联用等，不仅费时费力，且操作要求高，不适宜大批量的快速筛选，已不能满足社会对食品安全监管的需要。酶联免疫吸附法(ELISA)是目前常使用的一种检测方法，已有报道利用ELISA测定TeA的浓度，但由于需要酶标仪和操作熟练的人员以及检测时间相对较长，所以不适合现场快速检测。基于胶体金标记抗体与抗原特异性结合反应的免疫层析试纸条的检测结果肉眼可见，不需要大型仪器设备，检测成本低，分析时间短，从而可实现对各种真菌毒素的定性、在线、快速检测，但目前尚未见利用免疫层析试纸条检测TeA毒素的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供细交链格孢酮酸半抗原及其制备方法与应用。本专利技术的另一目的是提供一种快速检测细交链格孢酮酸的免疫层析试纸条及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的细交链格孢酮酸半抗原，其结构如式(I)所示：本专利技术还提供细交链格孢酮酸全抗原，由所述细交链格孢酮酸半抗原与载体蛋白偶联后得到的，即半抗原的羧基与载体蛋白的游离氨基发生缩合反应。其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白等；优选牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)。所述细交链格孢酮酸全抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。其中，所述TeA单克隆抗体是以TeA半抗原-载体蛋白偶联物(如TeA-BSA)作为免疫原，通过免疫试验动物，结合杂交瘤细胞制备技术获得的单抗。优选地，所述单抗的效价为1:270000。采用ELISA法测定所述单抗的效价。ELISA检测效价所用的包被原，其制备方法如下：取TeA半抗原8mg，加0.2mLDMF溶解，澄清，加入DCC4.13mg，加入NHS2.3mg，室温搅拌2h，过滤，除去沉淀物，得到半抗原活化液A液；取卵清蛋白(OVA)50mg，加8mL0.05mol/LpH7.2PB缓冲液溶解，得到B液，将A液缓慢滴加到B液中，室温搅拌反应5h。停止反应，0.02MPBS缓冲液透析3d，每天换液三次，得到TeA-OVA包被抗原，分装，-20℃保存，备用。本专利技术的细交链格孢酮酸半抗原可通过如下方法制备：将细交链格孢酮酸200mg和羧甲基羟胺半盐酸盐130mg溶解于10mL无水甲醇中，加入2mL98％冰醋酸，室温搅拌3h；减压蒸去有机溶剂，剩余水相通过制备液相色谱仪纯化，然后冻干即得。TeA半抗原合成路线见图1。本专利技术还提供由所述细交链格孢酮酸半抗原，或所述细交链格孢酮酸全抗原，或所述特异性抗体制备的细交链格孢酮酸检测试剂或试剂盒。本专利技术还提供所述细交链格孢酮酸半抗原，或所述细交链格孢酮酸全抗原，或所述特异性抗体，或所述检测试剂或试剂盒在细交链格孢酮酸的免疫分析检测中的应用。本专利技术还提供所述细交链格孢酮酸半抗原，或所述细交链格孢酮酸全抗原，或所述特异性抗体，或所述检测试剂在制备细交链格孢酮酸的胶体金检测试纸条中的应用。本专利技术还提供一种快速检测细交链格孢酮酸的免疫层析试纸条(图4)，包括样品垫、胶体金结合垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上设有检测线和质控线，所述样品垫、胶体金结合垫、反应膜和吸水垫依次粘贴在底板上。优选地，所述胶体金结合垫1/3～1/2被覆盖于样品垫下。其中，所述胶体金结合垫上包被有细交链格孢酮酸特异性抗体-胶体金标记物，所述细交链格孢酮酸特异性抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体；所述检测线包被有所述细交链格孢酮酸全抗原(例如TeA半抗原-OVA偶联物)，所述质控线包被有羊抗鼠二抗。所述细交链格孢酮酸特异性抗体-胶体金标记物的制备方法如下：用还原剂将氯金酸还原成胶体金纳米颗粒；将胶体金与细交链格孢酮酸特异性抗体混合孵育30min，加入牛血清白蛋白使其终浓度为1％，反应30min后；离心纯化、浓缩即得细交链格孢酮酸特异性抗体-胶体金标记物。优选地，所述还原剂为1％柠檬酸三纳水溶液。所述胶体金的纳米颗粒大小为13～40nm，更优选为18nm。在本专利技术的一个具体实施方式中，TeA单克隆抗体-胶体金标记物的制备如下：取制备好的粒径大小为18nm的胶体金溶液2mL，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至8.0；随后逐滴加入200μL浓度为20-100μg/mL(优选100μg/mL)的TeA单克隆抗体，室温条件下磁力搅拌反应2h；逐滴加入10％的BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积分数)，室温条件下磁力搅拌反应30min；加入10％的PEG20000溶液，并使其终浓度为0.2％，室温条件下磁力搅拌30min；12000rpm离心30min，弃上清，收集胶体金沉淀；沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液重悬沉淀重悬，置4℃备用。其中，所述复溶缓冲液为：0.02％～0.1％酪蛋白(质量分数)、0.05％～0.2％(质量分数)吐温-80、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。优选地，复溶缓冲液为：0.02％酪蛋白(质量分数)、0.05％(质量分数)吐温-80、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品垫可为吸滤纸或滤油纸；所述胶体金结合垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜。优选地，本专利技术所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株TeA分泌产生的单抗。杂交瘤细胞株TeA现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNO.15582，保藏日期2018年4月3日。本专利技术还提供所述免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：(1)制备喷涂有TeA单克隆抗体-胶体金标记物的胶体金结合垫；(2)制备具有包被有TeA半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠二抗的质控线的反应膜；(3)将步骤(1)和(2)制备好的胶体金结合垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。具体地，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.细交链格孢酮酸半抗原，其特征在于，其结构如式(I)所示：
【技术特征摘要】
2018.02.12 CN 20181014598171.细交链格孢酮酸半抗原，其特征在于，其结构如式(I)所示：2.细交链格孢酮酸全抗原，其特征在于，由权利要求1所述细交链格孢酮酸半抗原与载体蛋白偶联后得到的；其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选牛血清白蛋白、卵清蛋白。3.由权利要求2所述细交链格孢酮酸全抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。4.权利要求1所述细交链格孢酮酸半抗原的制备方法，其特征在于，将细交链格孢酮酸200mg和羧甲基羟胺半盐酸盐130mg溶解于10mL无水甲醇中，加入2mL98％冰醋酸，室温搅拌3h；减压蒸去有机溶剂，剩余水相通过制备液相色谱仪纯化，然后冻干即得。5.由权利要求1所述细交链格孢酮酸半抗原，或权利要求2所述细交链格孢酮酸全抗原，或权利要求3所述特异性抗体制备的细交链格孢酮酸检测试剂或试剂盒。6.权利要求1所述细交链格孢酮酸半抗原，或权利要求2所述细交链格孢酮酸全抗原，或权利要求3所述特异性抗体，或权利要求5所述检测试剂或试剂盒在细交链格孢酮酸的免疫分析检测中的应用。7.权利要求1所述细交链格孢酮酸半抗原，或权利要求2所述细交链格孢酮酸全抗原，或...
【专利技术属性】
技术研发人员：王蒙，韦迪哲，冯晓元，姜冬梅，付海龙，
申请(专利权)人：北京农业质量标准与检测技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京,11
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