AFB1电化学免疫传感器及其制备方法及其用于AFB1的检测技术

本发明专利技术公开了提供一种用于检测黄曲霉毒素B1的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：1)制备羧基化石墨烯‑金(COOH‑GO‑Au)复合纳米材料；2)制备修饰电极；3)在37℃下，将黄曲霉毒素B1抗体孵育于以上COOH‑GO‑Au修饰好的玻碳电极上，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，37℃下用牛血清白蛋白溶液封闭未识别的活性位点，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，37℃下孵育黄曲霉毒素B1抗原于上述电极表面，孵育30min后，用磷酸盐缓冲液漂洗，晾干，得电化学免疫传感器。由此构建的AFB1电化学免疫传感器感应性能良好，能够对实际样品进行快速测定。

AFB1 electrochemical immunosensor and its preparation method and its application to AFB1 detection

The invention discloses a preparation method of an electrochemical immunosensor for detecting aflatoxin B1, including the following steps: 1) preparation of carboxylated graphene gold (COOH GO Au) composite nanomaterials; 2) preparation of modified electrodes; 3) incubation of aflatoxin B1 antibody in above COOH GO Au modified at 37 (?) On the glassy carbon electrode, the electrode was washed with phosphate buffer, dried, sealed with bovine serum albumin solution at 37 C, washed with phosphate buffer, dried, and incubated with aflatoxin B1 antigen on the surface of the electrode. After incubation for 30 minutes, phosphorus was used. The acid buffer is rinsed and dried to obtain an electrochemical immunosensor. The AFB1 electrochemical immunosensor has good sensing performance and can be used for rapid determination of real samples.

【技术实现步骤摘要】
AFB1电化学免疫传感器及其制备方法及其用于AFB1的检测
本专利技术涉及纳米材料制备
，尤其涉及一种羧基化石墨烯负载金纳米粒子的制备方法，将羧基化石墨烯负载的金纳米粒子用于构建AFB1电化学免疫传感器，并用于AFB1的检测。
技术介绍
黄曲霉毒素是一种具有较强毒性的生物毒素，常见的种类有AFB1、AFG2、AFG1、AFB2、AFM1和AFM2等十几种结构相似的化合物[7]，其结构特征为：一个双呋喃环、一个氧杂萘邻酮，双呋喃环为基本毒性结构，氧杂萘邻酮与致癌有关。它的相对分子质量在312-346之间，纯品为无色晶体，极易溶解在机溶剂中，如甲醇、氯仿和乙醇等常见有机溶剂中，不易溶于水，不易分解，分解温度超过268℃，但可被强碱分解，而且紫外线对低浓度的黄曲霉毒素有一定破坏作用。黄曲霉毒素会损害人体的器官，抑制人体的免疫机能，其中以AFB1毒性最高，相当于KCN的10倍，As2O3的68倍，且在自然界中存在量最大。因而世界卫生组织(WHO)把AFB1定为IA类致癌物质，是对人类健康危害造成非常严重的一类霉毒素。目前，AFB1检测方法主要包括以下几种：酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)等。其中，酶联免疫法特异性强，成本低，且灵敏度高，但在酶促反应过程中，酶的活性容易受到介质组成和操作条件的影响，导致方法的准确性不够理想，通常仅用于样品筛检。高效液相色谱法需要采用固相萃取、超临界流体萃取、免疫亲和层析或固相分离柱等方法，来净化样品以提高选择性，这种方法耗时而且耗费。薄层层析法操作步骤过多，样品前处理复杂，很容易受到杂质的干扰。而电化学免疫检测法操作简便，检测灵敏度好、选择活性性好，更适合用于微量元素的检测。
技术实现思路
为了解决以上问题的一个或多个，本专利技术提供AFB1电化学免疫传感器及其制备方法及其用于AFB1的检测。根据本专利技术的一个或多个，提供一种用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：1)制备COOH-GO-Au复合纳米材料取聚乙烯吡咯烷酮和抗坏血酸溶于二次水中，溶解完全后加入羧基化石墨烯，将该混合液加热到80-120℃，加热10-30min，然后逐滴加入氯金酸，搅拌反应3-5h，待颜色变为红棕色，用乙醇离心清洗得COOH-GO-Au复合纳米材料；2)制备修饰电极先将玻碳电极依次用不同粒径的A12O3粉末在麂皮上抛光，依次用HNO3，无水乙醇、二次蒸馏水各超声1-3min，晾干备用，移取步骤1)制备好的COOH-GO-Au复合纳米材料滴涂在玻碳电极表面，晾干用蒸馏水冲洗，晾干；3)在37℃下，将上述COOH-GO-Au/GCE于anti-AFB1中孵育，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；接着将电极置于牛血清白蛋白溶液中，37℃孵育以封闭活性位点，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，最后将上述电极在AFB1溶液中37℃孵育30min后，用磷酸盐缓冲液漂洗，晾干，得到COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1免疫传感器。在一些实施方式中，玻碳电极的直径为3mm。在一些实施方式中，聚乙烯吡咯烷酮为105mg，抗坏血酸为180mg，羧基化石墨烯为3.0mg，氯金酸为3mL3mmolL-1。在一些实施方式中，Al2O3粉末的粒径依次是1.0μm、0.5μm、0.03μm。在一些实施方式中，anti-AFB1的浓度为150μg.mL-1。在一些实施方式中，anti-AFB1抗体的孵育时间为40min。在一些实施方式中，磷酸盐缓冲液的pH为7。在一些实施方式中，anti-AFB1的免疫时间为30min。根据本专利技术的另一个方面，提供应用前述制备方法制得的AFB1电化学免疫传感器。根据本专利技术的另一个方面，应用前述的AFB1电化学免疫传感器用于AFB1的检测。石墨烯(Graphene)是一种具有单原子厚度的新型二维结构的碳纳米材料，由单层碳原子排列堆积而成单层二维蜂窝状晶体，具有结构稳定，比表面积大、电阻率极低、导电能力强、催化效率高、表面反应活性高以及吸附能力强等优异性质；另一方面，石墨烯是一种零带隙材料，掺杂其它原子可以调控其能带结构，大大提高了材料的电催化性能。石墨烯表面是惰性的，化学稳定性较高，且石墨烯之间存在较强的范德华力，容易聚集，且其聚合物在基体中的分散性差，不易溶于水及其他有机溶剂中，不利于其研究及应用的进一步扩展。为了使石墨烯优良性能得以广泛应用，就必须要对石墨烯的表面进行改性。通过引入其它特定的官能团，可赋予石墨烯新的性质，进一步拓展它的应用领域。纳米金因其无毒性和优异的生物相容性被广泛应用于传感器领域，将金纳米复合材料用于电极表面的修饰，可有效增大电极比表面积，加快电子传递速率，提高电极的导电性，负载更多目标物，提高传感器的稳定性，加速传感器的响应等优点。金纳米粒子具有比表面积大、催化效率高、良好的生物兼容性及稳定性等优点，可有效保持生物酶或生物活性物质的活性，提高电化学生物传感器的灵敏度和目标物的固定效率。本专利技术相比于现有技术具有以下有益效果是：本专利技术检测AFB1最简单、耗时耗费较少。根据羧基化石墨烯、金纳米粒子良好的生物相容性，稳定性好，导电性高，反应活性高等许多独特的优点，本专利技术将性能优良的羧基化石墨烯和金纳米粒子结合在一起制备羧基化石墨烯-金复合纳米材料(COOH-GO-Au)，得到的COOH-GO-Au复合纳米材料兼具了两者的优良性能，将制备的复合纳米材料用于构建电化学免疫传感器对AFB1进行检测。构建的AFB1电化学免疫传感器感应性能良好，能够对实际样品进行快速测定，与现有的检测方法相比具有快速检测的优势。附图说明图1为本专利技术的COOH-GO-Au复合纳米材料的扫描电镜图；图2为本专利技术的COOH-GO和COOH-GO-Au的紫外光谱图；图3为在含有0.1molL-1KCl的1.0mmolL-1Fe(CN)63-/4-的PBS(pH＝7)溶液中不同材料构建的传感器的循环伏安图；图4为在含有0.1molL-1KCl的1.0mmolL-1Fe(CN)63-/4-的PBS(pH＝7)溶液中不同材料构建的传感器的阻抗图；图5为COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器在含有0.1molL-1KCl1.0mmolL-1Fe(CN)63-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中的电流响应与抗体浓度的关系图；图6为COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器在含有0.1molL-1KC11.0mmolL-1Fe(CN)63-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中的电流响应与抗体固定时间的关系图；图7为COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1免疫传感器在含有0.1molL-1KC1的1.0mmolL-1Fe(CN)63-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中响应电流与溶液pH的关系图；图8为COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器在含有0.1molL-1KC1的1.0mmolL-1Fe(CN)63-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中响应电流与抗原免疫时间的关系图；图9为在含有0.1molL-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备羧基化石墨烯‑金复合纳米材料取聚乙烯吡咯烷酮和抗坏血酸溶于二次蒸馏水中，溶解完全后加入羧基化石墨烯，将该混合液加热到80‑120℃，加热10‑30min，逐滴加入氯金酸，继续搅拌反应3‑5h，待颜色变为红棕色，用乙醇离心清洗得羧基化石墨烯‑金复合纳米材料；2)制备修饰电极先将玻碳电极用Al2O3粉末在麂皮上抛光后，依次用HNO3，无水乙醇、二次蒸馏水各超声1‑3min，晾干备用，移取步骤1)制备好的COOH‑GO‑Au复合纳米材料滴涂在玻碳电极表面，晾干，用蒸馏水冲洗，晾干，得到COOH‑GO‑Au/GCE传感器；3)在37℃下，将上述COOH‑GO‑Au/GCE于AFB1抗体中孵育，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；接着将电极置于牛血清白蛋白溶液中，37℃孵育以封闭活性位点，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，最后将上述电极在AFB1溶液中37℃孵育30min后，用磷酸盐缓冲液漂洗，晾干，得到COOH‑GO‑Au‑anti‑AFB1‑BSA‑AFB1免疫传感器。

【技术特征摘要】
1.用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备羧基化石墨烯-金复合纳米材料取聚乙烯吡咯烷酮和抗坏血酸溶于二次蒸馏水中，溶解完全后加入羧基化石墨烯，将该混合液加热到80-120℃，加热10-30min，逐滴加入氯金酸，继续搅拌反应3-5h，待颜色变为红棕色，用乙醇离心清洗得羧基化石墨烯-金复合纳米材料；2)制备修饰电极先将玻碳电极用Al2O3粉末在麂皮上抛光后，依次用HNO3，无水乙醇、二次蒸馏水各超声1-3min，晾干备用，移取步骤1)制备好的COOH-GO-Au复合纳米材料滴涂在玻碳电极表面，晾干，用蒸馏水冲洗，晾干，得到COOH-GO-Au/GCE传感器；3)在37℃下，将上述COOH-GO-Au/GCE于AFB1抗体中孵育，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；接着将电极置于牛血清白蛋白溶液中，37℃孵育以封闭活性位点，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，最后将上述电极在AFB1溶液中37℃孵育30min后，用磷酸盐缓冲液漂洗，晾干，得到COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1免疫传感器。2.根据权利要求1所述的用于检测AFB1的电化学免疫传感...

【专利技术属性】
技术研发人员：石玲，王泽锋，刘卫，杨光明，陈显兰，苟高章，
申请(专利权)人：红河学院，
类型：发明
国别省市：云南,53