一种食品中AGEs含量的检测方法技术

本发明专利技术涉及食品中AGEs含量的检测方法，包括以下步骤：调节待测食品的pH值，并对待测食品进行粉碎、振荡、离心，取其上清液并配置为系列浓度的待检测样品以及配置系列浓度的标准品并分别加入HRP进行标记得到HRP标记的标准品；采用BSA溶液对微孔板进行包被制得BSA修饰的微孔板；采用CML单克隆抗体对BSA修饰的微孔板进行包被制得特异性抗体包被的微孔板；将系列浓度HRP标记的标准品和系列浓度的待检测样品加入至特异性抗体包被的微孔板中并标记为A组，将系列浓度HRP标记的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中并标记为B组，分别进行发光处理，分别计算A组和B组底物降解量之差，获取待检测样品中AGEs含量数据。该方法具有高灵敏度、操作简便的优点。

A method for determination of AGEs content in foods

The invention relates to a detection method for AGEs content in food, which includes the following steps: adjusting the pH value of the food to be tested, crushing, oscillating and centrifuging the food to be tested, taking its supernatant and configuring the samples to be tested with a series of concentrations and the standard products with a series of concentrations, and adding HRP separately to label the food to be labeled with HRP. Qualified products; BSA-modified microporous plates were prepared by coating the microporous plates with BSA solution; BSA-modified microporous plates were coated with CML monoclonal antibodies to prepare specific antibody-coated microporous plates; HRP-labeled standard products and samples of series concentration to be tested were added to the microporous plates coated with specific antibodies. Group A was labeled as group A. The standard products labeled with HRP were added to another specific antibody coated microporous plate and labeled as group B. The difference of substrate degradation between group A and group B was calculated, and the AGEs content data in the samples to be tested were obtained. This method has the advantages of high sensitivity and simple operation.

【技术实现步骤摘要】
一种食品中AGEs含量的检测方法
本专利技术涉及食品检测领域，更具体地说，涉及一种食品中AGEs含量的检测方法。
技术介绍
晚期糖基化终末产物(advancedglycationendproductsAGEs)主要通过美拉德反应形成，是在非酶促条件下，蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一组稳定的不可逆的终末产物。研究表明，AGEs在体内的积聚与糖尿病、肾病、心(脑)血管疾病、心衰、动脉(粥样)硬化、衰老、猝死等多种疾病的发生、发展、预后都有密切的关系，已经成为公认的多种疾病、事件、死亡的独立强烈预测因子，也是“健康人”发生意外的强烈预测因子。AGEs包括羧甲基赖氨酸(CML)、羧乙基赖氨酸(CEL)、戊糖苷素(pentosidine)等。相比较而言，CML更加常见和稳定，也是AGEs的主要抗原表位，可作为免疫检测的指示。目前已经制定了CML的单克隆抗体，用于AGEs检测和定位等研究。研究表明，日常膳食中含有大量的AGEs，是外源性AGEs主要来源。食品中的AGEs含量与食品的营养成分(高蛋白高脂肪食物中AGEs含量最高)和加工方式有密切关系，随着加热时间的延长和加热程度的增加，AGEs的形成急剧增加，并通过膳食摄入进入体内。已经证明控制膳食AGEs摄入和参加体育锻炼是安全地减少血液循环中AGEs的方法。我国人群膳食结构中存在大量油炸、烘烤食品，且消费人口多，消费量大，有必要对不同加工方式食品中的AGEs进行摸底，指导膳食。研究表明，相比较其他种类的AGEs,CML更加常见和稳定，并检测方法也较成熟，常作为食品和生物体系中美拉德反应的指示。传统的AGEs检测方法主要有ELISA、质谱等方法，前者灵敏度存在一定的局限性，而后者需要繁琐的前处理过程。基于气相色谱-质谱连用，或者液相色谱-质谱连用。检测方法复杂，所需的仪器设备和实验室条件要求也较高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，提供一种能够解决食品中AGEs含量检测存在灵敏度低，检测复杂，检测所需仪器设备和实验条件要求高等弊端的检测方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种食品中AGEs含量的检测方法，包括以下步骤：调节待测食品的pH值，并对所述待测食品进行粉碎、振荡、离心，取其上清液并配置为系列浓度的待检测样品，以及配置系列浓度的标准品并分别加入HRP进行标记得到HRP标记的标准品；采用BSA溶液对微孔板进行包被，制得BSA修饰的微孔板；采用CML单克隆抗体对所述BSA修饰的微孔板进行包被，制得特异性抗体包被的微孔板；将系列浓度HRP标记的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组，将将所述系列浓度HRP标记的的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组，分别进行发光处理，计算A组和B组底物降解量之差，获待检测样品中取AGEs含量数据。优选地，所述S1步骤包括以下步骤：待测食品为固体食品，称取该待测的固体食品，将所述待测的固体食品剪碎并研磨至糊状或小颗粒状；加入PBS缓冲溶液至研磨后的所述待测固体食品中制得样品混合液；对所述样品混合液进行超声波粉碎，获得均匀且呈乳状的样品溶液；对所述样品溶液进行振荡、离心、静置取上清液并配置为系列浓度的待检测样品。优选地，所述S1步骤包括以下步骤：待测食品为液态食品，量取待测的液体食品，加入PBS缓冲溶液至所述待测的液体食品中并搅拌至混合均匀制得样品混合液；对所述样品混合液进行超声波粉碎，获得均匀且呈乳状的样品溶液；对所述样品溶液进行振荡、离心、静置取上清液并配置为系列浓度的待检测样品。优选地，所述步骤S2包括以下子步骤：S2.1、采用等离子处理方法对微孔板进行表面处理；S2.2、采用碳酸缓冲溶液溶解BSA，制得BSA溶液；S2.3、将所述BSA溶液加入所述步骤S2.1经表面处理后的微孔板中，在低温条件下轻摇过夜，弃去孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，再使用蒸馏水洗涤，制得BSA修饰的微孔板。优选地，在所述步骤S2.2中，所述BSA溶液的浓度为3-5mg/ml；在S2.3步骤中，所述低温条件为0～4℃。优选地，在所述步骤S2和步骤S3之间还包括对所述BSA修饰的微孔板进行溴乙酸羧基功能化处理步骤。优选地，所述步骤S3包括以下子步骤：S3.1、采用新配置的EDC/NHS对经所述溴乙酸羧基功能化后的所述BSA修饰的微孔板进行活化；S3.2、制备CML单克隆抗体溶液，并将所述CML单克隆抗体溶液加入所述步骤S3.1活化后的微孔板中，并轻弹混匀，在35～40℃摇床中反应；S3.3、弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤；S3.4、使用乙醇胺溶液封闭剩余的活性位点，弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，制得特异性抗体包被的微孔板。优选地，在步骤S2.2中，所述CML单克隆抗体溶液的浓度为2-20μg/ml。优选地，所述步骤S4包括以下子步骤：S4.1、将所述系列浓度HRP标记的的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将将所述系列浓度HRP标记的的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组；分别使用不干胶封片封盖A组和B组的微孔板，并置于35～40℃振荡孵育30～60min；S4.2、分别弃去所述微孔板孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤；S4.3分别加入化学发光液进行发光显色，采用多功能酶标仪进行数据采集并绘制标准曲线，计算A组和B组底物降解量之差，获待检测样品中取AGEs含量数据。优选地，所述化学发光液包括第一底物发光液和第二底物发光液；所述第一底物发光液包括鲁米诺、对碘苯酚、Tris-缓冲溶液；所述第二底物发光液包括双氧水、Tris-缓冲溶液。实施本专利技术的食品中AGEs含量的检测方法，具有以下有益效果：该食品中AGEs含量的检测方法既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且检测过程中不使用有害的试剂，试剂保持期长，具有较好的市场前景。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中：图1是本专利技术食品中AGEs含量的检测方法的流程图；图2是本专利技术食品中AGEs含量的检测方法的对比例1的柱状图；图3是本专利技术食品中AGEs含量的检测方法的对比例2的柱状图。具体实施方式为了对本专利技术的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本专利技术的具体实施方式。该食品中AGEs含量的检测方法涉及一种微孔板表面的改性方法，以及基于修饰的孔板上建立一种食品中AGEs含量的化学发光免疫检测方法。其可用于固体食品、液体食品中AGEs含量进行检测，其主要通过检测食品中AGES中的CML的含量进而得到AGES含量，该检测方法既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且检测过程中不使用有害的试剂，试剂保持期长，具有较好的市场前景。如图1所示，该食品中AGEs含量的检测方法包括以下步骤：S1、调节待测食品的pH值，并对所述待测食品进行粉碎、振荡、离心，取其上清液并配置为系列浓度的待检测样品，以及配置系列浓度的标准品并分别加入HRP进行标记得到HR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、调节待测食品的pH值，并对所述待测食品进行粉碎、振荡、离心，取其上清液并配置为系列浓度的待检测样品；以及配置系列浓度的标准品并分别加入HRP进行标记得到HRP标记的标准品；S2、采用BSA溶液对微孔板进行包被，制得BSA修饰的微孔板；S3、采用CML单克隆抗体对所述BSA修饰的微孔板进行包被，制得特异性抗体包被的微孔板；S4、将所述系列浓度HRP标记的的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组；分别进行发光处理，分别计算A组和B组底物降解量之差，获取待检测样品中AGEs含量数据。

【技术特征摘要】
1.一种食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、调节待测食品的pH值，并对所述待测食品进行粉碎、振荡、离心，取其上清液并配置为系列浓度的待检测样品；以及配置系列浓度的标准品并分别加入HRP进行标记得到HRP标记的标准品；S2、采用BSA溶液对微孔板进行包被，制得BSA修饰的微孔板；S3、采用CML单克隆抗体对所述BSA修饰的微孔板进行包被，制得特异性抗体包被的微孔板；S4、将所述系列浓度HRP标记的的标准品和所述系列浓度的待检测样品加入至所述特异性抗体包被的微孔板中，并标记为A组；将所述系列浓度HRP标记的的标准品加入另一个特异性抗体包被的微孔板中，并标记为B组；分别进行发光处理，分别计算A组和B组底物降解量之差，获取待检测样品中AGEs含量数据。2.根据权利要求1所述的用于食品中AGEs含量检测的试剂盒，其特征在于，所述S1步骤包括以下步骤：待测食品为固体食品，称取该待测的固体食品，将所述待测的固体食品剪碎并研磨至糊状或小颗粒状；加入PBS缓冲溶液至研磨后的所述待测固体食品中制得样品混合液；对所述样品混合液进行超声波粉碎，获得均匀且呈乳状的样品溶液；对所述样品溶液进行振荡、离心、静置取上清液并配置为系列浓度的待检测样品。3.根据权利要求1所述的用于食品中AGEs含量检测的试剂盒，其特征在于，所述S1步骤包括以下步骤：待测食品为液体食品，量取待测的液体食品，加入PBS缓冲溶液至所述待测的液体食品中并搅拌至混合均匀制得样品混合液；对所述样品混合液进行超声波粉碎，获得均匀且呈乳状的样品溶液；对所述样品溶液进行振荡、离心、静置取上清液并配置为系列浓度的待检测样品。4.根据权利要求1所述的食品中AGEs含量的检测方法，其特征在于，所述步骤S2包括以下子步骤：S2.1、采用等离子处理方法对微孔板进行表面处理；S2.2、采用碳酸缓冲溶液溶解BSA，制得BSA溶液；S2.3、将所述BSA溶液加入所述步骤S2.1经表面处理后的微孔板中，在低温条件下轻摇过夜，弃去孔中溶液，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤，再使用蒸馏水洗涤，制得BSA修饰的微孔板。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱凤，何建安，刘春晓，
申请(专利权)人：深圳市南山区疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广东,44