一种荧光成像方法、实时差分超分辨显微成像方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种荧光成像方法，将两种荧光材料结合制备成一复合荧光材料，复合荧光材料在双波长激光激发下产生两道主要部分不重合的荧光信号；成像时，分别采用对应波长的激光激发复合荧光材料，发出相应波段的荧光。根据上述荧光成像方法可进行实时荧光差分超分辨显微成像。本发明专利技术通过调制两束波长激光分别形成高斯光和空心光，通过激光扫描显微装置，分别激发同一复合荧光材料两部分不同荧光信号，进一步使用两个探测通道同时记录两种模式图像，进而将两个通道荧光信号直接相减得到超分辨图像。本发明专利技术无需控制切换光束，仅单次扫描即可实现超分辨显微成像，可以解决现有STED技术中大功率损耗光和FED技术中两次扫描的缺陷。

Fluorescence imaging method, real-time differential super-resolution microscopic imaging method and device

The invention discloses a fluorescence imaging method, which combines two kinds of fluorescent materials to prepare a composite fluorescent material, and the composite fluorescent material generates two main non-overlapping fluorescent signals under the excitation of dual-wavelength laser; when imaging, the composite fluorescent material is respectively excited by the corresponding wavelength laser to emit fluorescence in the corresponding band. Light. According to the above fluorescence imaging method, real-time fluorescence differential super-resolution microimaging can be carried out. By modulating two wavelength lasers to form Gauss light and hollow light respectively, the invention excites two different fluorescent signals of the same composite fluorescent material through a laser scanning microscopic device, and further records two mode images simultaneously using two detection channels, thereby directly subtracting the fluorescent signals of the two channels to obtain super-scores. Identify the image. The invention can realize super-resolution microscopic imaging without controlling the switching beam, and can solve the defects of high power loss light in STED technology and twice scanning in FED technology.

【技术实现步骤摘要】
一种荧光成像方法、实时差分超分辨显微成像方法及装置
本专利技术属于光学显微
，具体涉及一种实现双波长激励的荧光成像方法，以及利用一次扫描的荧光信号相减实现实时荧光差分超分辨显微成像方法及显微成像装置。
技术介绍
基于激光扫描成像的受激发射损耗显微术(Stimulatedemissiondepletionmicroscopy,STED)，采用高斯型聚焦激光扫描样品成像的同时，采用另一束环形光聚焦损耗荧光点周围荧光，得到更小的荧光点，进而扫描得到超分辨荧光图像。由于其实时、快速及超高分辨率等特点，被广泛应用于亚细胞结构及其他细胞生物学问题的研究中。单STED技术需要应用高功率损耗光，不可避免地带来光损伤等问题，为了克服这个缺陷，有研究小组探索出无需损耗荧光的荧光差分成像(Fluorescenceemissiondifferencemicroscopy,FED)方法，通过将一激光束先分离并将其中一束转变为空心光束后再耦合，在低功率激发下，实现适用于多数荧光材料的超分辨成像。这种FED技术仍有其局限，通常需要切换两束光进行两次扫描，局限了成像速度及其应用范围。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种荧光成像方法，该方法基于一复合荧光材料，采用该材料通过两个不同波长可高效地激发两种不同的荧光，通过将两个通道荧光信号直接相减可实现成像。本专利技术的另一个目的在于提供一种采用上述荧光成像方法，仅单次扫描即可实现实时差分超分辨显微成像的方法，可以解决现有STED技术中大功率损耗光和FED技术中两次扫描的缺陷，实现低功率激发的实时超分辨成像。本专利技术的另一个目的在于提供一种基于上述超分辨显微成像方法的显微成像装置，该装置利用连续激光器，无需控制切换光束，成本低易实现。本专利技术的目的通过以下的技术方案实现：一种荧光成像方法，将两种荧光材料结合制备成一复合荧光材料，复合荧光材料在双波长激光激发下产生两道主要部分不重合的荧光信号；成像时，分别采用对应波长的激光激发复合荧光材料，发出相应波段的荧光。具体的，所述复合荧光材料是发光纳米颗粒和/或标记物中两种材料的组合，该组合满足以下条件：两种材料的吸收光谱和荧光光谱都有不重叠部分，一种荧光材料的吸收光谱不与另一荧光材料的荧光发射光谱重合。当然，为了能够实际应用，两种材料需能稳定、均匀地结合在一起。作为一种优选，所述复合荧光材料的具体结构是两种稀土离子掺杂上转换纳米材料合成核壳结构。更进一步的，两种稀土离子掺杂上转换纳米材料为两种能够自敏化自发光的稀土离子单掺杂，或者由一种敏化离子搭配一激活离子共掺杂构成。作为一种优选，所述复合荧光材料是两种荧光分子的一对一结合，所述荧光分子包括有机荧光染料分子、荧光蛋白和荧光素，结合方式可以通过将荧光分子修饰到互补单链DNA上再通过配对形成DNA双链实现，或通过将不同荧光分子分别修饰到一抗、二抗，生物素、链霉亲和素上，通过其特异性结合偶联结合成分子对。作为一种优选，所述复合荧光材料是发光纳米颗粒表面包覆有机荧光染料分子，所述发光纳米颗粒包括稀土掺杂上转换纳米颗粒、量子点、纳米金颗粒，包覆过程通过共价键结合、化学基团交联或静电吸方法实现。一种实时差分超分辨显微成像方法，包括以下步骤：在一路，第一激光器产生稳定的第一波长激光，该激光经过准直后，经高倍物镜聚焦后获得聚焦的高斯型实心光斑；同时在另一路，第二激光器发出一稳定的第二波长激光，该激光经过准直后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，再经过二分之一玻片、1/4玻片形成右旋的圆偏振光，经高倍物镜聚焦后获得空心光斑；第一波长激光和第二波长激光通过二向色镜进行共轴耦合，保证聚焦后形成的所述高斯型实心光斑与所述空心光斑三维重合；经过扫描装置聚焦到样品上的空心光斑和实心光斑分别激发材料不同波段的荧光，这两个波段荧光在波长上可分离；通过带通滤光片，使用两个光电探测器对两部分荧光信号分开探测；扫描装置对耦合光斑进行XYZ扫描的同时，信号采集器记录这两部分信号，传输到计算机处理并显示两个通道的图像，将实心激光束激发的第二通道荧光图像和空心激光束激发的第一通道荧光图像相减即得到实时的超分辨图像。一种基于上述超分辨显微成像方法的显微成像装置，包括激发光生成模块、激光扫描显微模块、双通道光电探测模块、信号采集器及处理模块；所述激发光生成模块用于生成用作近红外激发光的双波长耦合近红外稳态激光束，该激光束通过激光扫描显微模块聚焦在载物台上标记了稀土掺杂上转换纳米材料的样品上，双通道光电探测模块用于检测上述样品被双波长激发的双通道荧光信号，由信号采集器采集双通道光电探测模块的电信号后传输到处理模块中，实时显示生成的双通道荧光图像和差分荧光图像。具体的，所述激发光生成模块，用于生成所需的双波长耦合近红外稳态激光束，包括第一光纤耦合激光器、第二光纤耦合激光器，两个激光器分别产生所需的两个波长单模激光输出，激光分别经二分之一玻片和线偏振器调节光束功率后，利用反射镜和二向色镜使两波长激光完全重合，空间相位调制板将第二光纤耦合激光器产生的激光束转换为空心的拉盖尔高斯光束，经第三二分之一波片调节空心光束的偏振方向后，结合后面光路中四分之一玻片将空心光束转变为圆偏振光。具体的，所述双通道探测模块，包括荧光二向色镜、第一通道荧光滤光片、第二通道荧光滤光片、第一荧光聚焦透镜、第二荧光聚焦透镜、第一通道光电探测器、第二通道光电探测器，荧光二向色镜将双波长激发光激发的两种不同波段的荧光分离，先分别经第一通道荧光滤光片、第二通道荧光滤光片进行滤光，然后分别由第一荧光聚焦透镜、第二荧光聚焦透镜聚焦到第一通道光电探测器、第二通道光电探测器，将光信号转换为电信号，第一通道光电探测器记录第一光纤耦合激光器产生的实心光斑激发的荧光图像，第二通道光电探测器记录第二光纤耦合激光器产生的空心光斑激发的荧光图像。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：1、本专利技术提出将两种荧光材料结合制备成一复合荧光材料，使其在双波长激光激发下产生两主要部分不重合的荧光信号，进而可用于荧光成像。基于上述方法，可提升荧光差分超分辨成像的成像速度。在现有的单波长两次扫描实现的荧光差分成像方法基础上，更进一步实现双通道单次扫描得到需要的图像信息，便于软件直接处理同步实时输出超分辨荧光差分图像。2、本专利技术中应用材料为上转换纳米材料时，具有非常良好的光学特性，包括无光漂白，无光闪烁，无细胞毒性等。使用的激发波长为连续光，具有穿透深度大，光损伤小，光散射小，不会激发细胞的自发荧光等优点。有利于在多光子超分辨成像中实行长时间的三维成像。3、本专利技术中应用材料为量子点或荧光染料分子的组合时，具有寿命短(数纳秒)，成像速度更快等优势。附图说明图1为本专利技术双波长复合材料不同波段荧光并进行差分成像的概念示意图。图2为本专利技术实施例1中复合材料NaYF4:Nd3+@NaYF4@NaYF4：Yb3+/Ho3+的结构图。图3为本专利技术实施例1中复合材料NaYF4:Nd3+@NaYF4@NaYF4：Yb3+/Ho3+的发光原理图。图4为本专利技术实施例1中所用不同波长获得的材料荧光光谱图。图5为本专利技术实施例1中复合材料NaYF4:Nd3+@NaYF4@NaYF4：Yb3+/Ho3+本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光成像方法，其特征在于，将两种荧光材料结合制备成一复合荧光材料，复合荧光材料在双波长激光激发下产生两道主要光谱成分不重叠的荧光信号；成像时，分别采用对应波长的激光激发复合荧光材料，发出相应波段的荧光。

【技术特征摘要】
1.一种荧光成像方法，其特征在于，将两种荧光材料结合制备成一复合荧光材料，复合荧光材料在双波长激光激发下产生两道主要光谱成分不重叠的荧光信号；成像时，分别采用对应波长的激光激发复合荧光材料，发出相应波段的荧光。2.根据权利要求1所述的荧光成像方法，其特征在于，所述复合荧光材料是发光纳米颗粒和/或标记物中两种材料的组合，该组合满足以下条件：两种材料的吸收光谱和荧光光谱都有不重叠部分，一种荧光材料的吸收光谱不与另一荧光材料的荧光发射光谱重合。3.根据权利要求2所述的荧光成像方法，其特征在于，复合荧光材料的具体结构是两种稀土离子掺杂上转换纳米材料合成核壳结构。4.根据权利要求3所述的荧光成像方法，其特征在于，两种稀土离子掺杂上转换纳米材料为两种能够自敏化自发光的稀土离子单掺杂，或者由一种敏化离子搭配一激活离子共掺杂构成。5.根据权利要求2所述的荧光成像方法，其特征在于，所述复合荧光材料是两种荧光分子的一对一结合，所述荧光分子包括有机荧光染料分子、荧光蛋白和荧光素，结合方式可以通过将荧光分子修饰到互补单链DNA上再通过配对形成DNA双链实现，或通过将不同荧光分子分别修饰到一抗、二抗，生物素、链霉亲和素上，通过其特异性结合偶联结合成分子对。6.根据权利要求2所述的荧光成像方法，其特征在于，所述复合荧光材料是发光纳米颗粒表面包覆有机荧光染料分子，所述发光纳米颗粒包括稀土掺杂上转换纳米颗粒、量子点、纳米金颗粒，包覆过程通过共价键结合、化学基团交联或静电吸方法实现。7.一种实时差分超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：在一路，第一激光器产生稳定的第一波长激光，该激光经过准直后，经高倍物镜聚焦后获得聚焦的高斯型实心光斑；同时在另一路，第二连续激光器发出一稳定的第二波长激光，该激光经过准直后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，再经过二分之一玻片、1/4玻片形成右旋的圆偏振光，经高倍物镜聚焦后获得空心光斑；第一波长激光和第二波长激光通过二向色镜进行共轴耦合，保证聚焦后形成的所述高斯型实心光斑与所述空心光斑三维重合；经过扫描装置聚焦到样品上的空心光斑和实心光斑分别激发材料不同波段的荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹求强，吴秋生，黄冰如，周超，黄文雯，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44