一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法技术

本发明专利技术提供了一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，涉及生物分析领域。其包括：以第一引物对作为砂糖桔黄龙病病原菌的分子检测引物，对待测样品基因组进行PCR扩增，确定患病植株DNA样品；构建患病植株DNA样品的16SrDNA文库；采用高通量测序技术对患病植株DNA样品进行检测并对患病植株DNA样品中的菌落组成进行分析。这种检测方法，可在不分离培养植物菌落的前提下对感染黄龙病的沙糖橘进行分析，方法的准确度高，容易实施。

A method for detecting colony of Citrus tangerine in infected with Huanglong disease

The invention provides a method for detecting bacterial colonies in salted tangerine infected with Huanglong disease, which relates to the field of biological analysis. It includes: using the first primer as the molecular detection primer of the pathogenic bacteria of Citrus Yellow Dragon disease, amplifying the genome of the tested samples by PCR to determine the DNA samples of the diseased plants; constructing the 16SrDNA Library of the diseased plants'DNA samples; using high-throughput sequencing technology to detect the diseased plants' DNA samples and in the diseased plants'DNA samples. The colony composition was analyzed. This method can be used to analyze Salt Orange infected with Huanglong disease without isolating and culturing plant colonies. The accuracy of this method is high and easy to implement.

【技术实现步骤摘要】
一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法
本专利技术涉及生物分析领域，具体而言，涉及一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法。
技术介绍
砂糖桔是广东重要的柑桔品种，由于近年来柑桔黄龙病的不断蔓延扩散，黄龙病已严重威胁广东省整个砂糖桔产业安全，而根据政府数据统计，发病较为严重是清远英德和云浮等地区。发病砂糖桔属于典型黄龙病症状，叶片为“斑驳型黄化症状”，不均匀的黄绿相间；果实为“红鼻子果”，果实果柄部分桔红色，其余部分青色。柑桔黄龙病(CitrusHuanglongbing)是制约全球柑桔产业发展的的毁灭性病害。研究认为柑桔黄龙病分为两个种，亚洲韧皮杆菌(CandidatusLiberibacterasiatricus)，非洲韧皮杆菌(Ca.L.africanus)。由于韧皮杆菌的不可继代培养性，阻碍了其致病机理及防控研究工作进步发展，当前也没有防治柑桔黄龙病的确切高效方法。植物与植物内细菌群落属于动态发生过程，而一种发病病原菌的出现往往伴随着不同程度的微生态失调或菌群失衡。但由于绝大多数植物群落存在无法分离培养的难题，所以目前关于柑桔侵染黄龙病后的细菌群落组成所知甚少，不利于有效的防治柑桔黄龙病。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，通过这种检测方法，可在不分离培养植物菌落的前提下对感染黄龙病的沙糖橘进行分析，方法的准确度高，容易实施。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其包括：以第一引物对作为砂糖桔黄龙病病原菌的分子检测引物，对待测样品基因组进行PCR扩增，确定患病植株DNA样品；构建患病植株DNA样品的16SrDNA文库；采用高通量测序技术对患病植株DNA样品进行检测并对患病植株DNA样品中的菌落组成进行分析。与现有技术相比，本专利技术的有益效果例如包括：本专利技术提供的这种检测方法，通过将对黄龙病有较高特异性的第一引物对作为引物，采用常规PCR的分子检测法，筛选出感染黄龙病砂糖桔的患病植株DNA样品；再通过高通量测序分析患病植株DNA样品中的菌落组成，即可得出患病植株中的细菌菌群组成，进而为沙糖橘的黄龙病防治提供理论指导。此外，这种检测方法，可在不分离培养植物菌落的前提下对感染黄龙病的沙糖橘进行分析，方法的准确度高，容易实施。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为沙糖橘果园的30个砂糖桔样本DNA电泳结果；图2为3对引物在10个样品的PCR产物电泳结果；图3为沙糖橘果园正常生长样品和斑驳型黄化症状样品的PCR产物电泳结果；图4为30个样本的16SrDNAPCR产物电泳结果。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本实施方式提供一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其包括：步骤S1:以第一引物对作为砂糖桔黄龙病病原菌的分子检测引物，对待测样品基因组进行PCR扩增，确定患病植株DNA样品；进一步的，第一引物对的碱基序列如SEQIDNO:1～2所示，其中，SEQIDNO:1的序列为：GCGCGTATCCAATACGAGCGGCA；SEQIDNO:2的序列为：GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT。步骤S2：构建患病植株DNA样品的16SrDNA文库；进一步的，构建患病植株DNA样品的16SrDNA文库的步骤包括：以第二引物对为引物，对患病植株DNA样品进行16SrDNAPCR扩增。其中，第二引物对的基因如SEQIDNO:3～4所示：序列SEQIDNO:3为AACMGGATTAGATACCCKG；序列SEQIDNO:4为AGGGTTGCGCTCGTTG。再对扩增后的16SrDNA的各项指标进行检测，符合构建标准的入选16SrDNA文库。其中，16SrDNA文库的构建标准包括：a.入选16SrDNA文库中的DNA样品主带在10kb以上；b.入选16SrDNA文库中的DNA样品的OD(260/280)值为1.6～1.8，OD(260/230)值大于2。优选地，16SrDNAPCR扩增的20μL反应体系包括：正向引物(5μM)0.8μL，反向引物(5μM)0.8μL，FastPfu聚合酶0.4μL，模板DNA10ng，2.5mMdNTPs2μL，5×FastPfu缓冲液4μL，补双蒸水至20μL。更为优选的，16SrDNAPCR扩增的反应程序包括：退火温度为54～56℃，延伸温度为70～74℃。步骤S3：采用高通量测序技术对患病植株DNA样品进行检测并对患病植株DNA样品中的菌落组成进行分析。进一步的，经高通量测序技术测试得到的原始数据经数据拆分、引物序列的除去、拼接以及嵌合体的除去后，得到用于分析菌落组成的有效数据。优选地，有效数据中的碱基质量值大于20bp和30bp的碱基百分比均大于93％。优选地，拼接步骤包括：将碱基数目低于20bp的read进行过滤处理；将成对reads拼接组装一条序列；以及根据序列首尾两端的barcode进行样品区分，同时进行序列方向调整。更为优选的，将对reads拼接组装时的参数为：最小重叠区域的长度为10bp；拼接序列的重叠区域允许的最大错配比率小于0.2。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述：实施例本实施例提供一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，并通过患病植株中的细菌菌群组成与健康植株的细菌菌群组成之间的对比，探究出各种细菌菌群与柑桔黄龙病病原菌的相互关系。该方法具体包括：一、砂糖桔样品基因组总DNA的提取：1.1提取步骤：(1)剪取0.1g叶中脉，剪碎后置于2.0mL的离心管中，用均质仪打碎；(2)往装有0.1g韧皮部样品的2.0mL离心管中加入200μL已于65℃水浴加热25min的BufferPCB，置于生物样品均质仪(Bioprep-24)中高速震荡研磨6次，每次30s；(3)再加入400μL65℃预热的BufferPCB和12μLβ-巯基乙醇。震荡混匀，置于65℃恒温金属浴中水浴25min，每5min混匀一次；(4)加入20μLRNaseA(10mg/mL)，并室温酶解2min，以去除混杂的RNA；(5)加612μL的氯仿并震荡混匀，12,000rpm离心5min，小心吸取上清水相至一个干净灭菌的1.5mL的离心管中(切勿吸取到固液界面的蛋白层)；(6)加入等体积BufferBD，颠倒混匀3～5次，再加等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温静置2min，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；(7)将吸附柱重新放回收集管中，加入500μLPWSolution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；(8)将吸附柱放回收集管中，加入500μLWashSolution，10,000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液；(9)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm空管离心2min；(10)取出吸附柱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，其包括：以第一引物对作为砂糖桔黄龙病病原菌的分子检测引物，对待测样品基因组进行PCR扩增，确定患病植株DNA样品；构建所述患病植株DNA样品的16SrDNA文库；采用高通量测序技术对所述患病植株DNA样品进行检测并对所述患病植株DNA样品中的菌落组成进行分析。

【技术特征摘要】
1.一种感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，其包括：以第一引物对作为砂糖桔黄龙病病原菌的分子检测引物，对待测样品基因组进行PCR扩增，确定患病植株DNA样品；构建所述患病植株DNA样品的16SrDNA文库；采用高通量测序技术对所述患病植株DNA样品进行检测并对所述患病植株DNA样品中的菌落组成进行分析。2.根据权利要求1所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，所述第一引物对的碱基序列如SEQIDNO:1～2所示。3.根据权利要求1所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，构建所述患病植株DNA样品的16SrDNA文库的步骤包括：以第二引物对为引物，对所述患病植株DNA样品进行16SrDNAPCR扩增，其中所述第二引物对的基因如SEQIDNO:3～4所示；再对扩增后的16SrDNA的各项指标进行检测，符合构建标准的入选16SrDNA文库。4.根据权利要求3所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，所述16SrDNA文库的所述构建标准包括：a.入选所述16SrDNA文库中的DNA样品主带在10kb以上；b.入选所述16SrDNA文库中的DNA样品的OD(260/280)值为1.6～1.8，OD(260/230)值大于2。5.根据权利要求3所述的感染黄龙病的沙糖橘中的菌落检测方法，其特征在于，所述16Sr...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄江华，肖婉钰，李志杰，万爽，曾文圣，张旭娜，
申请(专利权)人：仲恺农业工程学院，
类型：发明
国别省市：广东,44