本发明专利技术公开了尿液中miR‑214作为肾脏纤维化的生物标志物的新用途，同时提出了一种通过检测尿液miR‑214来早期诊断和动态监测肾脏纤维化的试剂盒。研究结果表明，在慢性肾脏病患儿的尿液中检测miR‑214具有重要的临床意义，为临床判断肾脏纤维化的程度提供重要的依据，可以早期干预肾脏纤维化的进展。
Use of miR-214 in urine as a biomarker for renal fibrosis
The invention discloses a new use of urine microRNA 214 as a biomarker of renal fibrosis, and proposes a kit for early diagnosis and dynamic monitoring of renal fibrosis by detecting urine microRNA 214. The results showed that the detection of microRNA 214 in urine of children with chronic kidney disease has important clinical significance, which provides an important basis for clinical judgment of the degree of renal fibrosis and can interfere with the progress of renal fibrosis at an early stage.
【技术实现步骤摘要】
尿液中miR-214作为肾脏纤维化的生物标志物的用途
本专利技术涉及miR-214的新应用，具体地涉及尿液中miR-214作为肾脏纤维化的生物标志物的新用途。
技术介绍
肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病(CKD)进展到终末期肾衰竭(ESRD)的共同病理基础，其病理生理过程主要包括：包括肾小管上皮细胞在内的肾脏固有细胞损伤与阶段、纤维形成的信号传递阶段、纤维形成阶段和肾脏损害阶段。其中，肾小管上皮细胞损伤及损伤后诱发的一系列生物化学反应是启动和推进肾小管间质纤维化的主要因素。蛋白尿是众多慢性肾脏疾病的共同特点，包括儿童肾脏疾病。其中部分患儿在治疗后会痊愈，但仍有部分患儿存在持续的蛋白尿，而目前认为，长期大量蛋白尿总是与肾间质损害伴随出现。使用大剂量牛血清白蛋白构造大鼠白蛋白超载实验发现，在蛋白尿出现后很短时间内即出现了肾间质炎症，进而出现肾间质纤维化和肾功能损害。因此这部分持续大量蛋白尿患儿会逐渐出现肾间质纤维化，进而走向终末期肾病。目前肾脏纤维化诊断主要依赖肾穿刺活检这一有创性检查手段，由于这一技术本身的技术要求、侵入性及家长和患儿存在的恐惧心理等诸多因素，使得对慢性肾病患儿的肾脏穿刺仅在频繁复发或治疗效果不佳等情况下才能进行，可能会错失治疗肾脏纤维化、延缓肾脏损伤的最佳时机。近年来，尿液中微小RNA(microRNA，miRNA)引起了人们的关注。miRNA是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，通过与靶基因mRNA互补结合而调控靶基因的表达，参与生物体内的多种病理生理过程。miRNAs可以稳定存在人的体液中，因此可以作为基本诊断的标志物。已有研究发现尿液中miRNA的表达水平与肾脏疾病密切相关，如狼疮性肾炎、IgA肾病、急性肾损伤等。但尚未有有关尿液中miR-214作为肾脏纤维化的生物标志物的报道。
技术实现思路
本专利技术意外的发现了尿液中miR-214可以作为肾脏纤维化的生物标志物，尤其发现在慢性肾脏病患儿尿液中miR-214的表达降低，与蛋白尿的程度呈负相关。本专利技术进一步提出了一种通过检测尿液中miR-214预测肾脏纤维化程度的试剂盒，所述试剂盒包括miR-214逆转录相关引物、miR-214PCR相关引物、逆转录Mix试剂、逆转录缓冲液、实时定量PCRMix反应试剂、内参U6逆转录相关引物、U6PCR相关引物、逆转录Mix的试剂和PCRMix反应试剂。其中，miR-214及U6逆转录和PCR相关引物购自广州锐博生物科技有限公司。逆转录Mix试剂购自日本Takara公司，实时定量PCRMix反应试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司。具体地，所述试剂盒包括盒体和盒盖，其中，所述盒盖的内表面分别设置有可擦涂磁性板和条码区，所述条码区包含试剂盒中试剂保存和配置信息，可擦涂磁性板可用于实验人员随手记录实验信息；所述盒体包括上、中、下三层，其中，上层和中层相同，均被分为8个分区，每个分区内设置试管孔，分别用于放置装有miR-214逆转录相关引物的试剂管、装有miR-214PCR相关引物的试剂管、装有逆转录Mix的试剂管、装有逆转录缓冲液的试剂管、装有实时定量PCRMix反应试剂的试剂管、装有内参U6逆转录相关引物的试剂管和装有U6PCR相关引物的试剂管以及白板笔；盒体的下层被分隔为两个空腔，两个空腔内分别设置有可抽拉的抽屉，在可抽拉的抽屉内分别填充冷冻材料。优选地，所述的可抽拉的抽屉外侧设置有拉环。盒体的中层和下层之间通过隔板隔开。有益效果与现有技术相比，本专利技术具有以下的优点和积极效果：(1)本本专利技术通过简单的检测尿液中miR-214的表达量来预测肾脏纤维化的程度，避免了肾穿刺活检这一有创性检查手段，为临床判断肾脏纤维化的程度提供重要的依据，可以早期干预肾脏纤维化的进展；(2)所设计的试剂盒结构合理，使用方便，便于携带保存；(2)本专利技术的试剂盒在检测miR-214的表达量时，通过荧光信号积累实时监测整个PCR进程，可以更加准确、便捷的得到监测结果，而且自动化程度高，有效降低污染，便于临床监测推广。附图说明图1为miR-214在尿检正常儿童(normal)以及肾病综合征患儿(NS)的尿液中的表达；图2为miR-214在轻、中、重度蛋白尿患者尿液中的表达以及与蛋白尿的相关性；图3为miR-214在轻、中、重度蛋白尿患者肾穿刺活检组织中的表达以及与蛋白尿的相关性；图4为Fibronectin(作为纤维化的标志物)在轻、中、重度蛋白尿患者肾穿刺活检组织中的表达以及与miR-214的相关性；图5为检测尿液中miR-214预测肾脏纤维化程度的试剂盒的结构示意图。具体实施方式本专利技术意外地发现了尿液中miR-214可以作为肾脏纤维化的生物标志物，尤其发现在慢性肾脏病患儿尿液中miR-214的表达降低，与蛋白尿的程度呈负相关。为了更方便的检测尿液中miR-214的表达量，本专利技术还提出了一种通过检测尿液中miR-214预测肾脏纤维化程度的试剂盒，所述试剂盒包括miR-214逆转录相关引物、miR-214PCR相关引物、逆转录Mix试剂、逆转录缓冲液、实时定量PCRMix反应试剂、内参U6逆转录相关引物、U6PCR相关引物、逆转录Mix的试剂和PCRMix反应试剂。其中，miR-214及U6逆转录和PCR相关引物购自广州锐博生物科技有限公司。逆转录Mix试剂购自日本Takara公司，实时定量PCRMix反应试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司。具体地，试剂盒包括盒体1和盒盖2，其中，盒盖的内表面分别设置有可擦涂磁性板3和条码区4，条码区包含试剂盒中试剂保存和配置信息，可擦涂磁性板可用于实验人员随手记录实验信息。盒体包括上、中、下三层，其中，上层5和中层6相同，均被分为8个分区，每个分区内设置试管孔，分别用于放置装有miR-214逆转录相关引物的试剂管、装有miR-214PCR相关引物的试剂管、装有逆转录Mix的试剂管、装有逆转录缓冲液的试剂管、装有实时定量PCRMix反应试剂的试剂管、装有内参U6逆转录相关引物的试剂管和装有U6PCR相关引物的试剂管以及白板笔；盒体的中层和下层之间通过隔板隔开盒，体的下层7被分隔为两个空腔，两个空腔内分别设置有可抽拉的抽屉，在可抽拉的抽屉内分别填充冷冻材料，可抽拉的抽屉外侧设置有拉环8。下层为整个试剂盒的冷冻区，可用于对需要冷藏的试剂进行保存，如装有逆转录Mix的试剂管和装有PCRMix反应试剂的试剂管。在使用时，在每个试剂管的上端标记试剂管的名称或标记符号作为标识，检测时将盒体的上层取下，各个试剂管会露出标识部分，从而可清楚的分辨每个试剂管，取下的上层可进一步用于放置已经加过样的试剂管。本研究在临床收集52例慢性肾脏病患儿(不同程度蛋白尿，初诊，未做过任何治疗)和46例尿检正常儿童的随机尿液，通过检测尿液中miR-214的表达，结果如图1所示，发现在慢性肾脏病患儿尿液中miR-214的表达降低，与蛋白尿的程度呈负相关。具体地，尿液中miR-214的表达通过如下方法检测：(1)尿液中microRNA的提取：1.收取的尿液3000rpm，离心10min，取上清500ul，加入Trizol500μl，剧烈涡旋震荡30s，室温静置5min；2.加入200μl异丙醇，颠倒混匀，剧烈涡旋震荡2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.尿液中miR‑214作为肾脏纤维化的生物标志物的用途。
【技术特征摘要】
1.尿液中miR-214作为肾脏纤维化的生物标志物的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，在慢性肾脏病患儿尿液中miR-214的表达降低，与蛋白尿的程度呈负相关。3.一种通过检测尿液中miR-214预测肾脏纤维化程度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括miR-214逆转录相关引物、miR-214PCR相关引物、逆转录Mix试剂、逆转录缓冲液、实时定量PCRMix反应试剂、内参U6逆转录相关引物、U6PCR相关引物、逆转录Mix的试剂和PCRMix反应试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体和盒盖，其中，所述盒盖的内表面分别设置有可擦涂磁性板和条码区，所述条码区包含试剂盒中试剂保...
【专利技术属性】
技术研发人员：张爱华，白咪，贾占军，张玥，黄松明，于晓文，雷娟，郭燕，陈爽，杜阳，
申请(专利权)人：南京市儿童医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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