一种定向聚合的荧光探针PCR制造技术

一种定向聚合的荧光探针PCR，其特征是常规引物、探针特异结合外增设各自定向聚合，采用对侧原引物5'端一段反向碱基序列，按5'‑3'方向加至引物对前面，形成“5'反向互补序列”嵌合引物对而定向聚合，借助5'端互补使扩增产物3'尾也互为模板、互为引物扩增，在PCR超敏基础上进一步提高灵敏度3‑5Ct和降低非特异性，或同样灵敏度情况可减少扩增5个循环；荧光探针3'加长尾端与探针中部序列反向互补两‑两自身杂交，从而借尾部‑中部两处相互聚合使淬灭基团靠近荧光基团降低基线荧光和探针非特异性，一旦长序列靶分子链特异杂交引物、探针链，相对竞争力弱的两两聚合引物对、探针解链而特异结合靶分子进行扩增、探针被聚合酶水解产生与靶分子成正比的荧光。

A directional polymerized fluorescent probe PCR

A directional polymerized fluorescent probe polymerase chain reaction is characterized by conventional primers and specific combination of probes with additional directional polymerizations. A reverse base sequence at the 5'end of the opposite primer is used and added to the front of the primer pair in the direction of 5'3'. A chimeric primer pair of \5' reverse complementary sequence\ is formed and directional polymerizations are made with the help of 5'end complementarity. The 3'tail of the product is also template and primer amplification. On the basis of PCR hypersensitivity, the sensitivity of 3 5CT is further improved and the non-specificity is reduced, or the same sensitivity can reduce the amplification of 5 cycles. The fluorescent probe 3'lengthens the tail and the middle sequence of the probe complement each other in reverse way, so that the tail and the middle part of the probe can hybridize with each other. Polymerization reduces baseline fluorescence and probe nonspecificity by bringing quenched groups closer to fluorescent groups. Once a long sequence of target molecular chain specific hybridization primers and probe chains, two or two pairs of polymer primers with weak relative competitiveness, probe chain-breaking and specific binding to target molecules are amplified, and probe is hydrolyzed by polymerase to produce fluorescence proportional to target molecules.

【技术实现步骤摘要】
一种定向聚合的荧光探针PCR
：本专利技术属于分子生物学及核酸扩增PCR检测领域，具体涉及定向引物对5’端互补结合、增敏和水解探针3’端聚合、解链的荧光探针PCR技术。
技术介绍
：核酸扩增PCR技术是随着现代分子生物学的进步而一起发展、成熟的，早在1953年，核酸DNA双螺旋模型及半保留复制开启了现代分子生物学时代及奠定了聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)的基础，甚至Khorana于1971年就直接提出了核酸体外扩增的模式：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的KaryMullis在研究单向核酸测序时产生了核酸扩增的灵感:于试管中模拟天然DNA双向扩增的指数复制。提供一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，就可以成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。经过一系列探索、发展和耐热聚合酶、热循环仪的专利技术、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR专利技术专利(USPatent4,683,202)。PCR技术以其独有的高灵敏度、强特异性、简便快速和纯度要求低的特点而成为生命科学研究的核心基础技术。但传统的PCR(又称为终末PCR)需将产物凝胶电泳检测进行结果分析，传统的PCR由于PCR产物量变异大的局限性，只能检测反应终末产物的定性而不能精确定量，同时也没有解决气雾胶污染、引物二聚体、非特异性扩增等难题，因此传统的PCR结合产物凝胶电泳检测或和印迹方法不适用于临床检验等应用检测。1992年Higuchi等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式荧光检测方式对目的基因数量进行分析，为解决传统PCR的难题提出了新思路。1996年由美国AppliedBiosystems公司推出实时荧光定量PCR技术，所谓实时荧光定量PCR技术(BioTechniques1997,22:130-138)，是指实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量(产物标记荧光强度)与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物量增加的荧光信号达到对数期的循环数Ct值(Cyclethreshold)与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到同样对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数(Ct)。该技术实行完全闭管式操作，避免了传统PCR开盖引起的产物污染问题，减少了假阳性结果的出现，同时也避免了对环境的污染。相比于传统PCR电泳的方法，该技术操作简便，检测结果以更直观的曲线数据展现，从而对样本进行阳性、阴性和可疑的判定，保证了结果的准确性。实时荧光定量PCR扩增产物增加的信号既可通过染料法来显示，又可采用带淬灭基团的荧光探针法来检测。染料法即在PCR反应体系中，加入适量荧光染料(如SYBRGreenⅠ)，荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于传统PCR非特异性扩增产物干扰的假阳性问题。探针法即PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切水解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。与染料法相比，探针法在一定程度上避免假阳性问题的出现，其特异性有引物和探针双重保证，进一步增加结果的可信度。被淬灭的荧光探针即可以通过降解而激活，如1995年美国PE公司研制出了Taq酶水解的荧光标记探针及实时荧光定量PCR技术(LivakKJ,etal.,1995,GenomeRes:4:357-362)，于1997年申请了水解探针(商品名:TaqMan)PCR专利技术专利(USPatent6,485,903)，以及Epoch公司在水解荧光探针基础上增加小沟结合基团的MGB探针(USPatent7,205,105)。相较于TaqMan探针，该探针改善了本底信号的干扰，其较短的探针设计不但增强淬灭效果，降低了荧光背景，同时能够较好地区分等位基因，可以检测单核苷酸多态性(SNP)。2009年，美国的IgorV.Kutyavin提出了一种新的PCR检测技术-Snake系统(NucleicAcidsRes.2010,38(5)e29)，该系统通过在一条引物5’端添加一段与该条引物扩增产物探针5’端结合位点前面序列相同的特定碱基片段，使再一次扩增的产物自身3’端能够形成茎环状二级结构，再延伸、水解探针为Taq酶5’→3’外切酶活性最佳底物，增强了扩增产物荧光强度。不同于TaqMan，Snake系统可以使用较短的探针来改善荧光背景，在信号的产生和序列检测，尤其是单核苷酸检测方面有较强的优势。被淬灭的荧光探针也可以通过二级结构改变而激活，分子信标Molecularbeacon(TyagiS,etal,1996,NatBiotechnol14:303-308)正是这样一种茎环或/锅柄样结构的杂交探针，于1999年申请了Molecularbeacon专利技术专利(USPatent05925517)，这一结构使荧光基团与淬灭基团紧密接触，从而有效的解决了TaqMan较高的背景荧光问题，但产物信号由于淬灭解除不彻底而太弱。其它双杂交(FRET)探针，蝎形(Scorpion)探针，Sunrise-Primer，LuxPimers等使用范围局限于一定的应用，不明显优于水解探针TaqMan方法，且与TaqMan、MGB探针路线、原理不同。目前临床检验使用最广的还是水解探针TaqMan实时荧光PCR。然而实时荧光PCR灵敏度仍稍显不够，探针法实时荧光PCR多一道信号转换，每一个产物至多产生一个荧光基团而灵敏度更低一些。检测飞克fg/ml水平或个位数靶分子拷贝需要扩增至38个循环，随后开始出现外侧与内侧引物两步扩增的巢式PCR(JMedVirol,30-2:85)，其采用外侧引物预扩增15-30个循环来提高灵敏度,再加以内侧引物继续扩增25-30个循环以超过40个循环指数扩增的极高灵敏度甚至为单个靶分子检出提供了可能；且随着巢式PCR新反应成份的补充，也推迟了从指数形式或对数期进入所谓“停滞效应”平台期的时间，保持了2n级数的几何扩增效率。然而巢式PCR外侧引物增加了系统复杂性进而增加了两轮PCR非特异性，外引物的残留促进内侧引物非特异扩增，将一般常规引物本底Ct值30个循环的非特异性提升至Ct值﹤25个循环以前的本底非特异性；巢式或两轮PCR增加的非特异性抵消了第一轮或外侧引物预扩增的放大作用。预扩增需要取出至少稀释20-50倍以上或通过凝胶电泳纯化靶产物以除去外侧引物的影响才能消除系统增加的非特异性，不但增加操作复杂性而且PCR后处理亦带来产物气雾胶交叉污染风险。常规PCR检测终末反应-平台期扩增产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定向聚合的荧光探针PCR，其特征是引物、探针特异序列基础上设置定向的引物对5’端互补结合、增敏和荧光探针3’尾定向聚合、解链PCR，引物设计采用对侧原引物5'端5‑10b反向碱基序列，按5'‑3'方向加至引物对前面，形成“5'反向互补序列”嵌合引物对而定向聚合，借助5'互补使扩增产物3'尾也互为模板、互为引物扩增，以＞2n几何级数放大而增加灵敏度和竞争降低引物3'聚合PD非特异性；常规水解荧光探针3'末端添加与探针中部反向互补的5‑8b尾序列，形成两探针分子间借尾部‑中部两处靠近的相互杂交而定向聚合，探针两端荧光素‑淬灭基团靠近而降低反应基线荧光，探针自身聚合抑制与引物间聚合非特异性；一旦长序列靶分子链竞争杂交引物、探针链，相对结合力弱的两两聚合引物对、探针解链而结合靶模板分子进行扩增、探针被聚合酶水解产生荧光。

【技术特征摘要】
1.一种定向聚合的荧光探针PCR，其特征是引物、探针特异序列基础上设置定向的引物对5’端互补结合、增敏和荧光探针3’尾定向聚合、解链PCR，引物设计采用对侧原引物5'端5-10b反向碱基序列，按5'-3'方向加至引物对前面，形成“5'反向互补序列”嵌合引物对而定向聚合，借助5'互补使扩增产物3'尾也互为模板、互为引物扩增，以＞2n几何级数放大而增加灵敏度和竞争降低引物3'聚合PD非特异性；常规水解荧光探针3'末端添加与探针中部反向互补的5-8b尾序列，形成两探针分子间借尾部-中部两处靠近的相互杂交而定向聚合，探针两端荧光素-淬灭基团靠近而降低反应基线荧光，探针自身聚合抑制与引物间聚合非特异性；一旦长序列靶分子链竞争杂交引物、探针链，相对结合力弱的两两聚合引物对、探针解链而结合靶模板分子进行扩增、探针被聚合酶水解产生荧光。2.根据权利要求1所述的一种定向聚合的荧光探针PCR，其特征在于，采用较短的5-7b对侧原引物5'反向序列作为添加人工序列加至相对引物前面，人工添加的序列与原引物序列间插入一短4b序列限制酶切位点，使扩增产物酶切后长度一致以便于电泳检测，同时预设的限制酶切+UDG酶解措施以防止扩增产物交叉二次污染。3.根据权利要求2所述的一种定向聚合的荧光探针PCR，其特征在于，所述的引物联合采用中部6-8个碱基同序的引物对以进一步减少引物二聚体PD程度/推后引物二聚体本底扩增Ct值，从而间接减少PD对靶扩增的竞争性抑制，提升系统灵敏度。4.根据权利要求1所述的一种定向聚合的荧光探针PCR，其特征在于，所述的荧光探针是指模板序列探针5'端标记荧光素且在PCR中可被DNA聚合酶的外切酶活性水解，探针3'末端添加与其中部反向互补的5-7b碱基，最末尾额外加一个A碱基结尾，尾A之后再标记淬灭基团；后加3'尾与中部反向互补序列之间变一个碱基为“反义”碱基，包括2'-FluoroRNA、2'-O-MethylRNA、2'-O,4'-C-methylenebridgeRNA；阻止漏标记的探针3'末端非特异聚合延伸，两两探针加尾与其中部预设互补区两段杂交而定向聚合；不仅加强抑制基线荧光，也规避了探针与过量引物间杂交非特异性。5.根据权利要求2或3所述的一种定向聚合的荧光探针PCR，其特征在于，所述的引物设计在常规引物选取基础上修改和增补一些减少本底、5'端定向互补引物设计原则：1)选取一对靶特异性基因跨度100-300bp两端序列18-24个核苷酸碱基长度作为上下游引物且3'末端间不能有连续反向互补；2)选取靶基因跨度300bp以内6-8b“倒置重复”置于一对引物离3'端2-6个碱基以外的中部作为中部同序引物；3)5'端反向互补—采用5-7b对侧原引物5'反向序列作为添加人工序列加至相对引物前面，人工添加的序列与原引物序列间插入一短4b序列限制酶切位点；4)一对引物的3'最末碱基选择A/AC结尾使扩增产物对应dU位于二聚体的原引物连接中间处；不要选氢键强“错配”多的G结尾,亦尽量不选氢键弱/特异性差的T结尾,更不要采用重复双GG/TT结尾，UDG酶解A/AC结尾引物的二聚体。6.根据权利要求4所述的一种定向聚合的荧光探针PCR，其特征在于，所述的探针设计在遵守一般常规荧光探针设计原则基础上的定向聚合荧光探针设计原则:1)首先选取靠近一端引物但序列不重叠的一段小于35nt的靶荧光探针序列但Tm值比引物Tm值要高10℃以上，且探针5'端不能是G碱基；2)探针5'端完全同TaqMan水解探针，可选择标记荧光素FAM，HEX、JOE、VIC或TET，ROX/Texas-Red，CY5；3)探针3'末端添加与其中部反向互补的5-7b碱基作为人工定向聚合3'末尾；4)探针3'最末尾额外再加一个A碱基结尾，尾A之后再标记淬灭基团TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明rhodamine)、BHQ1或DABCYL；5)后加3'末尾至中部需变一个碱基为反义“死”碱基，其保留Watson配对杂交性能而失去扩增模板和引物聚合作用,包括2'-FluoroRNA、2'-O-MethylRNA、2'-O,4'-C-me...

【专利技术属性】
技术研发人员：曲越，江洪，曲超琪，
申请(专利权)人：澳門帝傑數碼基因有限公司，
类型：发明
国别省市：中国澳门,82