一种生产尼莫克汀的方法技术

本发明专利技术提供了一种高效率生产尼莫克汀的方法，采用抗L‑缬氨酸的蓝灰链霉菌在L‑缬氨酸存在条件下进行发酵生产，解决了传统工艺里发酵中后期发酵产量增长缓慢的问题，延长了发酵周期，显著提高了尼莫克汀的发酵产率。

A method of producing nimodipine

The invention provides a method for producing nimodipine with high efficiency. Streptomyces cinerea resistant to L valine is used for fermentation production in the presence of L valine, which solves the problem of slow growth of fermentation yield in the middle and late stages of traditional fermentation, prolongs the fermentation period and significantly improves the fermentation yield of nimodipine.

【技术实现步骤摘要】
一种生产尼莫克汀的方法
本专利技术涉及一种微生物发酵方法，尤其涉及一种可提高尼莫克汀发酵产量的方法。
技术介绍
尼莫克汀(Nemadectin)是一种十六元大环内酯类抗生素，属于米尔贝霉素族的一员，由蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseussp.Noncyanogenus)经发酵产生，尼莫克汀经过半合成在其分子结构的C-23位引入＝N-OCH基团可以得到活性更强的抗生素莫西克汀(Moxidectin)。尼莫克汀的结构式为：莫西克汀20世纪80年代中期以来开始作为动物用驱虫药使用，能够高效的杀灭线虫和体表寄生虫等，同时对动物有很好的安全性，是一种新型的广谱、高效、安全的大环内酯类驱虫抗生素，目前已被广泛用于兽医临床，市场需求日益增大。因此，能够高效率生产尼莫克汀的方法是所期望的。
技术实现思路
为了提高尼莫克汀的生产效率，本专利技术提供了一种高效率生产尼莫克汀的方法。本专利技术所提供的生产尼莫克汀的方法，包括：含有蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseussp.Noncyanogenus)的发酵液中，加入L-缬氨酸，进行发酵。其中，所述蓝灰链霉菌为抗L-缬氨酸的蓝灰链霉菌；在发酵过程中，控制发酵液中蓝灰链霉菌生长因子质量浓度维持在0.1％-8％。在一种优选实施例中，所述蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseussp.Noncyanogenus)KS12-08，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2017年2月15日，保藏编号CGMCCNo.13661。在一种优选实施例中，所加入的L-缬氨酸占发酵液重量比例优选为0.01％-0.1％，更优选为0.02％-0.08％，如：0.04％、0.05％、0.06％、0.07％。在一种优选实施例中，所述蓝灰链霉菌发酵过程中，每天添加L-缬氨酸，每天添加的L-缬氨酸占发酵液重量比例优选为0.01％-0.1％，更优选为0.02％-0.08％，如：0.04％、0.05％、0.06％、0.07％。在一种优选实施例中，蓝灰链霉菌在发酵液中完成初级代谢后加入L-缬氨酸。在一种优选实施例中，至少在加入L-缬氨酸之后的发酵过程中，控制发酵液中蓝灰链霉菌生长因子质量浓度维持在0.2％-6％，更优选为0.4％-4％，更优选为0.5％-2％，更优选为0.7％-1.5％，如1％、1.2％。在一种优选实施例中，所述发酵过程中，当蓝灰链霉菌生长因子质量浓度低于1.5％时，进行补加蓝灰链霉菌生长因子。其中，所述蓝灰链霉菌生长因子优选为单糖、双糖、或寡糖中的一种或几种。其中，所述单糖可以是优选为苏力糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖中的一种或几种；所述双糖可以是优选为蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、乳糖、海藻糖中的一种或几种；所述寡糖优选为低聚果糖、低聚木糖、低聚麦芽糖、低聚异麦芽糖中的任意一种或几种。在一种优选实施例中，所述发酵过程中，发酵温度优选为20-35℃，更优选为25-33℃，如28℃、30℃。在一种优选实施例中，所述蓝灰链霉菌种子液接种至发酵培养基中，进行培养，获得所述发酵液。在一种优选实施例中，以所述发酵培养基总重量为基准，所述发酵培养基包括：葡萄糖8％，麦芽糊精4％，黄豆饼粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％。更优选地，当发酵液中葡萄糖质量浓度低于1.5％时，进行补加葡萄糖。在一种优选实施例中，所述蓝灰链霉菌孢子接种于种子培养基获得种子液。在一种优选实施例中，以所述种子培养基总重量为基准，所述种子培养基包括：麦芽糊精2.0％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，黄豆饼粉1.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％。在一种优选实施例中，所述蓝灰链霉菌制成孢子悬浮液，在含有L-缬氨酸的培养基中培养，进一步进行抗性筛选获得耐受L-缬氨酸的菌株并培养，得到孢子。本专利技术提供的生产尼莫克汀的方法，解决了传统工艺里发酵中后期发酵产量增长缓慢的问题，延长了发酵周期，显著提高了尼莫克汀的发酵产率。具体实施方式初始菌种为常规蓝灰链霉菌，将初始菌种通过斜面培养，后用斜面菌种制成孢子悬液，稀释至孢子浓度为108个/ml，向悬浮液中加入硫酸二乙酯溶液，然后放摇床中28℃震荡培养，用移液枪取出5ml孢子悬浮液置于6cm直径的培养皿中，放入搅拌子。然后通过紫外灯管照射诱变。将紫外诱变后的孢子悬浮液在红灯下稀释成一定的浓度梯度，分别取0.2ml涂布于培养基平板上，28℃避光培养7-8天，挑取单菌落筛选得到耐受L-缬氨酸的菌株，名称为蓝灰链霉菌(Streptomycescyaneogriseussp.Noncyanogenus)KS12-08，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2017年2月15日，保藏编号CGMCCNo.13661。16SrDNA序列检测结果显示，该诱变菌株CGMCCNo.13661属于蓝灰链霉菌。该诱变菌株CGMCCNo.13661孢子丝短，呈致密的2-3圈螺旋形，孢子呈卵圆形至短柱形，表面光滑；克式合成1号琼脂培养基中：气丝为粉状，基丝由最初无色变为后来的灰蓝色；耐受L-缬氨酸。实施例1步骤1，将蓝灰链霉菌KS12-08接种于斜面培养基，在温度28～30℃，湿度20～60％条件下培养7～8天，得到成熟的斜面菌种；斜面培养基包括：淀粉1.0％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，琼脂2.0％；步骤2，从成熟的斜面菌种刮取适量孢子接种于液体种子培养基中，在温度28～30℃，搅拌转速200～500rpm条件下培养26～30小时，得到成熟的种子液；种子培养基包括：麦芽糊精2.0％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，黄豆饼粉1.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％；步骤3，将成熟的种子液按照8～12％的接种量接种至发酵培养基中，在温度28～30℃，搅拌转速200～600rpm，罐压0.02～0.06MPa，罐上溶氧≥30％的条件下发酵培养；发酵培养基包括：葡萄糖8％，麦芽糊精4％，黄豆饼粉2.8％，酵母粉0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.01％，碳酸钙0.4％；将L-缬氨酸配制成适当浓度的溶液，灭菌后，发酵过程中，每天在发酵液中补入占发酵液0.05wt％的L-缬氨酸。实施例2步骤1，将蓝灰链霉菌KS12-08接种于斜面培养基，在温度28～30℃，湿度20～60％条件下培养7～8天，得到成熟的斜面菌种；斜面培养基包括：淀粉1.0％，葡萄糖0.5％，酵母粉0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.05％，碳酸钙0.1％，琼脂2.0％；步骤2，从成熟的斜面菌种刮取适量孢子接种于液体种子培养基中，在温度28～30℃，搅拌转速200～500rpm条件下培养26～30小时，得到成熟的种子液；种子培养基包括：麦芽糊精2.0％，葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，黄豆饼粉1.5％，硫酸镁0.1％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.2％；步骤3，将成熟的种子液按照8～12％的接种量接种至发酵培养基中，在温度28～30℃，搅拌转速200～600rpm，罐压0.02～0.06MPa，罐上溶氧≥30％的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产尼莫克汀的方法，其特征在于，包括：含有蓝灰链霉菌的发酵液中，加入L‑缬氨酸，进行发酵；所述蓝灰链霉菌为抗L‑缬氨酸的蓝灰链霉菌；在发酵过程中，控制发酵液中蓝灰链霉菌生长因子质量浓度维持在0.1％‑8％。

【技术特征摘要】
1.一种生产尼莫克汀的方法，其特征在于，包括：含有蓝灰链霉菌的发酵液中，加入L-缬氨酸，进行发酵；所述蓝灰链霉菌为抗L-缬氨酸的蓝灰链霉菌；在发酵过程中，控制发酵液中蓝灰链霉菌生长因子质量浓度维持在0.1％-8％。2.根据权利要求1所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，所述蓝灰链霉菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2017年2月15日，保藏编号CGMCCNo.13661。3.根据权利要求1所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，所加入的L-缬氨酸占发酵液重量比例为0.01％-0.1％。4.根据权利要求3所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，所述蓝灰链霉菌发酵过程中，每天添加L-缬氨酸，每天添加的L-缬氨酸占发酵液重量比例为0.01％-0.1％。5.根据权利要求1所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，蓝灰链霉菌在发酵液中完成初级代谢后加入L-缬氨酸。6.根据权利要求1所述的生产尼莫克汀的方法，其特征在于，加入L-缬氨酸之后的发酵过程中，控制发酵液中蓝灰链霉菌生长因...

【专利技术属性】
技术研发人员：马承国，
申请(专利权)人：上海莫息生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31