一种酿酒酵母发酵生产D-塔格糖的方法技术

技术编号:19384552 阅读:46 留言:0更新日期:2018-11-10 00:29
本发明专利技术涉及一种酿酒酵母发酵生产D‑塔格糖的方法,步骤如下:将根据酿酒酵母密码子偏好性优化基因GalE的密码子构建在酿酒酵母表达载体YCplac33上,得到载体1,所述表达载体YCplac33上带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因和酿酒酵母的筛选标记URA3基因;将上述重组的载体1转入野生型酿酒酵母W303中,根据酿酒酵母的筛选标记URA3,筛选阳性单克隆,再将阳性单克隆培养后提取该酵母基因组,进一步通过PCR验证,得到最终的发酵菌株;在一定条件下培养,待菌体长到一定浓度后;添加相应的底物果糖,35‑36℃,220‑250rpm反应5天,收集产生的D‑塔格糖,对产物塔格糖进行分离提纯。本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序,产品纯化工艺简单。

A method of producing D- tag by fermentation of Saccharomyces cerevisiae

The present invention relates to a method for fermentation of D tagatose by Saccharomyces cerevisiae. The steps are as follows: the codon of GalE gene optimized according to the codon preference of Saccharomyces cerevisiae is constructed on the Saccharomyces cerevisiae expression vector YCplac33, and the vector 1 is obtained. The expression vector YCplac33 contains ampicillin resistance gene of Escherichia coli and wine-making. The recombinant vector 1 was transformed into wild-type Saccharomyces cerevisiae W303. According to the screening marker URA3 of Saccharomyces cerevisiae, positive monoclones were screened, and then the yeast genome was extracted after positive monoclonal culture. The final fermentation strain was obtained by PCR verification under certain conditions. When the bacteria grow to a certain concentration, the D tag sugar is collected and purified by adding the corresponding substrate fructose at 35 36 C and 220 250rpm for 5 days. The process is separated and purified only in the last step of production, and the purification process is simple.

【技术实现步骤摘要】
一种酿酒酵母发酵生产D-塔格糖的方法
本专利技术涉及一种酿酒酵母发酵生产D-塔格糖的方法,属于合成生物学领域。
技术介绍
稀少糖(RareSugar)是自然界中存在但含量极少的一类单糖(糖的最小单位)和糖醇,和自然界大量存在的葡萄糖和果糖相比,非常稀少,约有50个种类。其味类似于蔗糖,但具有热量低、稳定性高、甜味协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点,可以弥补传统甜味剂的不足,被广泛应用于保健食品、婴幼儿配方食品,乳制品,饮料等食品中,尤其对改善特殊人群的饮食起到重要作用。稀少糖的益处还有很多,例如可以减少有毒物质(如内毒素、氨类等)的形成,对肠粘膜细胞和肝具有保护作用,可以调节肠道菌群,让某些微生物定植于肠道,并为其提供适宜的栖息环境,促进肠黏膜免疫功能的完善和影响、参与人体的多种代谢功能,从而防止病变肠癌的发生,增强机体免疫力。D-塔格糖是稀少糖的一种,近年被发现的一种具有特殊保健功能的功能甜味剂,其甜度与蔗糖相似,而产生的热量只为蔗糖的1/3,所以被称之为低热量甜味剂,具有能量低,可改善肠道菌群,降低血糖,抗龋齿等功能。2001年被美国食品与药物管理局(U.S.FoodandDrugAdministration,FDA)确定为普遍公认安全食品(GRAS)。随后D-塔格糖在美国被通用于健康饮料及酸乳、果汁等产品,作为蔗糖的代用品。同时还被广泛应用于糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等工业中,并在医药中被用于咳嗽糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的豁合剂及口腔消毒剂中。目前D-塔格糖在国际市场上的市场份额正逐年增加,国内市场还正在发展,由于中国人口基数大,糖尿病患者高居世界首位,功能性甜味剂市场广阔等,D-塔格糖在中国市场上具有极大的潜力。目前,D-塔格糖的合成方法主要是化学催化合成法和生物转化法,化学催化合成法是以半乳糖为原材料,通过金属氢氧化合物(常为Ca(OH)2)以及碱金属催化剂(常为CaCl2)催化半乳糖生成D-塔格糖-Ca复合物,再通过酸中和将塔格糖从复合物中释放出来,该方法具有原材料较贵、产生化学污染物、碱性条件副产物多、分离困难等诸多缺点。而生物转化法是通过L-阿拉伯糖异构酶将半乳糖转化为塔格糖,但同样该反应具有原材料较贵、转化效率低、产物分离难度大等缺点,很难实现工业化大规模生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术的不足,提供一种酿酒酵母发酵生产D-塔格糖的方法。该方法操作简捷、无污染、生产周期短、成本低、可持续生产及环境友好。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是:本专利技术的目的通过一下技术方案实现,具体路线见说明书附图1。所述方法步骤如下:1)将根据酿酒酵母密码子偏好性优化基因GalE的密码子构建在酿酒酵母表达载体YCplac33上,得到载体1,所述表达载体YCplac33上带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因和酿酒酵母的筛选标记URA3基因;2)将上述重组的载体1转入野生型酿酒酵母W303中,根据酿酒酵母的筛选标记URA3,筛选阳性单克隆,再将阳性单克隆培养后提取该酵母基因组,进一步通过PCR验证,得到最终的发酵菌株;3)将验证成功的单阳性单克隆菌株转接至液体培养基,在一定条件下培养;4)添加相应的底物果糖,35-36℃,220-250rpm反应5天,收集产生的D-塔格糖,对产物塔格糖进行分离提纯。优选的,所述步骤3)中液体培养基为LB培养基,其质量分数组成为:1%的胰化蛋白胨,0.5%的酵母抽提物,1%的NaCl,用NaOH调pH值至7.5,121℃灭菌20min备用。优选的,步骤3)中培养条件为温度35-36℃,搅拌转速220-250rpm,培养至菌体浓度OD660大于或等于0.8。本专利技术在酿酒酵母中通过尿苷二磷酸半乳糖-4-差向异构酶(GalE)实现了果糖到D-塔格糖的发酵生产,与上述合成方法的不同之处在于:以果糖为原材料,工艺原材料成本低;以改造微生物为技术基础,在微生物体内进行生物酶的催化合成,避免大规模的提取、分离、纯化过程,从生产成本和对环境友好方面容易控制。本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序,产品纯化工艺简单。本专利涉及到的基因为GalE(见表1)。表1专利中用到的物种物种拉丁名基因大肠杆菌Escherichiacolistr.K-12GalE附图说明图1本专利技术的D-塔格糖合成路线图。图2本专利技术中用到的质粒图谱。具体实施方式以下对本专利技术的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本专利技术,并非用于限定本专利技术的范围。实施例1质粒构建方法。本专利根究相应基因的氨基酸序列和酿酒酵母的密码子偏好性,优化出基因的核酸序列,送商业基因合成公司将基因合成,根据GalE的基因序列,按照附图2中的质粒图谱构建质粒Y33-GalE,相应片段间设计20bp左右大小的同源臂,片段与片段之间用商业试剂盒(一步克隆试剂盒)连接,再转化进入酿酒酵母细胞中,在相应缺陷型平板上挑取单克隆提取基因组,进行PCR验证,得到工程菌株用于后续进行诱导表达。实施例2转化过程。1)首先挑取阳性单克隆在相应的缺陷型培养基中,30℃,220rpm过夜培养12h;2)用分光光度计检测过夜培养的菌液的OD600的值;3)以初OD600值为0.2OD的菌液转接到50mL的新鲜YPAD培养基中;4)活化4-5小时让酿酒酵母增值两代使菌液的OD600值在0.8-0.9,3600rpm离心5min收集菌体,用25mLddH2O洗两次,充分洗去培养液;5)在超净台中用1mL无菌水将离心后的菌体重悬到无菌1.5mL离心管中;6)再12000rpm,离心30s收集菌体;7)在超净台中用1mL无菌水重悬上一步离心后的菌体,分装每管100μL用于转化,将分装的菌液在掌上离心机上离心20s弃去上清加转化体系。8)转化体系配比:PEG3350(50%(W/V过滤除菌))240ulLiAc1.0M(过滤除菌)36ulSSDNA(2.0mg/ml)50ul共转化DNA片段和水34ulTotal360ul。9)共转化所需的片段,按每个片段加入400ng混合混匀即可。10)用混合好的转化体系重悬菌体,于30℃培养箱中保温20min。11)再将混合好的转化体系在金属浴上42℃,热击40min后涂相应的筛选板,倒置放于30℃培养箱中培养2-3天,待转化子长出来,挑选单克隆,提基因组验证。实施例3催化合成塔格糖添加相应的底物果糖,35-36℃,220-250rpm反应24-36h,收集产生的D-塔格糖,对产物塔格糖进行分离提纯,液体培养基为LB培养基,其质量分数组成为:1%的胰化蛋白胨,0.5%的酵母抽提物,1%的NaCl,用NaOH调pH值至7.5,121℃灭菌20min备用。以上所述的实施例只是本专利技术的一种较佳的方案,并非对本专利技术作任何形式上的限制,在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。序列表<110>嘉兴欣贝莱生物科技有限公司<120>一种酿酒酵母发酵生产D-塔格糖的方法<130>201806<160>1<170>SIPOSequenceListin本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种酿酒酵母发酵生产D‑塔格糖的方法,其特征在于:所述方法步骤如下:1)将根据酿酒酵母密码子偏好性优化基因GalE的密码子构建在酿酒酵母表达载体YCplac33上,得到载体1,所述表达载体YCplac33上带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因和酿酒酵母的筛选标记URA3基因;2)将上述重组的载体1转入野生型酿酒酵母W303中,根据酿酒酵母的筛选标记URA3,筛选阳性单克隆,再将阳性单克隆培养后提取该酵母基因组,进一步通过PCR验证,得到最终的发酵菌株;3)将验证成功的单阳性单克隆菌株转接至液体培养基,在一定条件下培养;4)添加相应的底物果糖,35‑36℃,220‑250rpm反应5天,收集产生的D‑塔格糖,对产物塔格糖进行分离提纯。

【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母发酵生产D-塔格糖的方法,其特征在于:所述方法步骤如下:1)将根据酿酒酵母密码子偏好性优化基因GalE的密码子构建在酿酒酵母表达载体YCplac33上,得到载体1,所述表达载体YCplac33上带有大肠杆菌的氨苄霉素抗性基因和酿酒酵母的筛选标记URA3基因;2)将上述重组的载体1转入野生型酿酒酵母W303中,根据酿酒酵母的筛选标记URA3,筛选阳性单克隆,再将阳性单克隆培养后提取该酵母基因组,进一步通过PCR验证,得到最终的发酵菌株;3)将验证成功的单阳性单克隆菌株转接至液体培养基,在一定条件下培养;4)添...

【专利技术属性】
技术研发人员:夏文豪陈贤情蒿飞杨月王筱王文
申请(专利权)人:嘉兴欣贝莱生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:浙江,33

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