重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法技术

本发明专利技术公开了重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：S1、PET‑28a‑TEV蛋白酶表达质粒的构建；S2、TEV蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、TEV蛋白酶的纯化与鉴定。本发明专利技术应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中表达，再经过亲和层析、Superdex 75凝胶过滤层析等方法对目标蛋白酶进行提纯，大幅缩短了目标蛋白酶的纯化流程与纯化时间，同时提高了蛋白酶的纯度、得率和酶活，节省实验步骤并减少成本。本发明专利技术方法，为研发及生产其他蛋白类工具酶奠定了基础。

Production method of recombinant TEV protease in Escherichia coli

The invention discloses a production method of recombinant TEV protease in E. coli, including the following steps: construction of S1, PET 28a TEV protease expression plasmid; induction expression and identification of S2 and TEV protease; purification and identification of S3 and TEV protease. The expression system of Escherichia coli is applied to realize the expression of recombinant TEV protease in Escherichia coli by designing the expression vector, and then purify the target protease by affinity chromatography and Superdex 75 gel filtration chromatography, thus greatly reducing the purification process and purification time of the target protease, and increasing the eggs at the same time. The purity, yield and enzyme activity of white enzyme can save experimental steps and reduce costs. The method of the invention lays a foundation for developing and producing other protein type enzyme.

【技术实现步骤摘要】
重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法
本专利技术涉及聚合物反应领域，具体为重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法。技术背景目前，蛋白产量及活性不高是异源蛋白表达尤其是毒性蛋白表达的技术瓶颈。随着生物技术的发展，研究者应用融合表达策略克服毒性及难溶性蛋白的表达难关。TEV蛋白酶是来源于烟草蚀纹病毒(TEV)Nla的重组蛋白酶，此蛋白酶被用来切除纯化后融合蛋白的亲和标签。TEV蛋白酶具有很强的位点特异性，能够识别EXXYXQ(G/S)的七氨基酸序列(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)，最普通的是ENLYFQG，其切割位点在谷氨酰胺和甘氨酸或丝氨酸之间。该酶在PH5.5-8.5和4-30℃的广泛范围内皆有活性，使得反应条件的选择可根据目的蛋白的情况而修改。TEV蛋白酶能特应性地切割含TEV位点的融合蛋白，TEV蛋白酶切位点常被用于客户融合蛋白标签的切除，高纯度和高活性的TEV蛋白酶的研制成功将产生一定的商业价值。目前，市场上TEV蛋白酶，生物活性、纯度普遍较低，而且常见的TEV蛋白酶生产方法，步骤繁琐，成本较高。因此，研发一种重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，实现高纯度重组TEV蛋白酶的制备，从而节省实验步骤并减少成本，是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，以解决上述技术问题。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：S1、PET-28a-TEV蛋白酶表达质粒的构建；S2、TEV蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、TEV蛋白酶的纯化与鉴定。优选地，所述的步骤S1，具体分如下步骤：a、根据密码子优化后的基因序列，TEV蛋白酶直接进行基因合成；b、将PET-28a载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与基因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；c、取20ul重组产物转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ulLB液体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养45min，涂布于含50ug/mL卡那霉素的LB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；d、使用灭菌牙签从LB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含卡那霉素抗性的LB培养基中；37℃、200rpm条件下摇床培养过夜，抽提质粒并Sanger法测序。优选地，所述的步骤S2，具体分如下步骤：a、将步骤S1中经过Sanger法测序结果鉴定为阳性的PET-28a-TEV蛋白酶质粒转入感受态BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜；b、使用灭菌牙签挑取LB平板上单菌落置于含卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃、220rpm条件下培养过夜，以体积比1:100的比例接菌液于4ml含卡那霉素的LB培养基中，继续培养2.5h，OD600nm达到0.6～0.8时加入IPTG至0.5mM/L，于15℃过夜诱导蛋白表达；c、取诱导表达的2ml菌液，在12000rpm条件下离心1min收集菌体，加入100ul的1×蛋白电泳缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm条件下离心1min，取10ul菌体电泳缓冲液样品进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快速染色仪染色脱色10min，观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示在诱导表达后的菌体中出现与TEV蛋白酶理论分子量一致的表达条带，而诱导前的菌体中没有该条带存在，证明了TEV蛋白酶表达正常。优选地，所述步骤S3，具体分如下步骤：a、将S2-a步骤中过夜培养已转入PET-28a-TEV蛋白酶质粒的BL21(DE3)菌液以体积比1:100的比例接于800ml含卡那霉素LB中，37℃、220rpm条件下培养2h左右，OD600nm达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM/L，于15℃过夜诱导蛋白表达，8000rpm离心10min，收集菌体，-20℃保存；b、将-20℃冻存菌体加入细胞裂解液(比例为：1g菌体对应5mL细胞裂解液)，使用超声波破碎仪，低温条件下超声3秒，停10秒，共运行10分钟进行破菌，4℃、16000rpm条件下离心15min，分离上清液与沉淀；c、分别取上清液、沉淀，并采用SDS-PAGE法进行检测，检测结果为破碎后上清和沉淀中均有与TEV蛋白酶理论分子量一致的条带，上清中含有80％以上蛋白酶，说明破碎结果良好；d、将S3-b步骤中分离的上清液，置于干净的50ml的离心管中加入2mlNi柱，4℃孵育2h，先用细胞裂解液100ml清洗，再用含有20mM/L咪唑的洗脱液30ml进行洗脱，然后含有500mM/L咪唑的洗脱液5ml进行洗脱，最后将洗脱液以TEV蛋白酶储存液作为流动相过分子筛Superdex75，根据280nm紫外吸收值收集目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用12％的SDS-PAGE进行检测，从而制得纯化的TEV蛋白酶。优选地，在步骤S3-b、S3-d中，所述细胞裂解液中含有20mM/L的三羟甲基氨基甲烷、300mM/L的氯化钠、重量百分比为10％的甘油，所述细胞裂解液PH为8.0。本专利技术的有益效果在于：本专利技术应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中表达，再经过亲和层析和Superdex75凝胶过滤层析对TEV蛋白酶进行提纯，整个纯化过程仅需5～6h，简单的两步纯化方式整体大幅缩短了TEV蛋白酶的纯化流程与纯化时间，同时提高了TEV蛋白酶的纯度、得率和酶活，并且融合有His标签的TEV蛋白酶可对带有TEV位点的靶蛋白进行酶切后纯化，收集酶切后Ni柱流出液即可得到浓度及纯度较高的天然蛋白，与其他的酶切纯化方式相比节省实验步骤并减少成本。该TEV蛋白酶纯化工艺的新方法，为研发及生产其他蛋白类工具酶奠定了基础。具体实施方式为了便于本领域技术人员理解，下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1：重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：S1、PET-28a-TEV蛋白酶表达质粒的构建，具体分如下步骤：a、根据密码子优化后的基因序列，TEV蛋白酶直接进行基因合成；b、将PET-28a载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与基因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；c、取20ul重组产物转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ulLB液体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养45min，涂布于含50ug/mL卡那霉素的LB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；d、使用灭菌牙签从LB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含卡那霉素抗性的LB培养基中；37℃、200rpm条件下摇床培养过夜，抽提质粒并Sanger法测序。S2、TEV蛋白酶的诱导表达与鉴定，具体分如下步骤：a、将步骤S1中经过Sanger法测序结果鉴定为阳性的PET-28a-TEV蛋白酶质粒转入感受态BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜；b、使用灭菌牙签挑取LB平板上单菌落置于含卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃、220rpm条件下培养过夜，以体积比1:100的比例接菌液于4ml含卡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、PET‑28a‑TEV蛋白酶表达质粒的构建；S2、TEV蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、TEV蛋白酶的纯化与鉴定。

【技术特征摘要】
1.重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、PET-28a-TEV蛋白酶表达质粒的构建；S2、TEV蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、TEV蛋白酶的纯化与鉴定。2.根据权利要求1所述的重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，所述的步骤S1，具体分如下步骤：a、根据密码子优化后的基因序列，TEV蛋白酶直接进行基因合成；b、将PET-28a载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与基因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；c、取20ul重组产物转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ulLB液体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养45min，涂布于含50ug/mL卡那霉素的LB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；d、使用灭菌牙签从LB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含卡那霉素抗性的LB培养基中；37℃、200rpm条件下摇床培养过夜，抽提质粒并Sanger法测序。3.根据权利要求2所述的重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，所述的步骤S2，具体分如下步骤：a、将步骤S1中经过Sanger法测序结果鉴定为阳性的PET-28a-TEV蛋白酶质粒转入感受态BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜；b、使用灭菌牙签挑取LB平板上单菌落置于含卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃、220rpm条件下培养过夜，以体积比1:100的比例接菌液于4ml含卡那霉素的LB培养基中，继续培养2.5h，OD600nm达到0.6～0.8时加入IPTG至0.5mM/L，于15℃过夜诱导蛋白表达；c、取诱导表达的2ml菌液，在12000rpm条件下离心1min收集菌体，加入100ul的1×蛋白电泳缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm条件下离心1min，取10ul菌体电泳缓冲液样品进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利...

【专利技术属性】
技术研发人员：雍金贵，杜攀，李森，
申请(专利权)人：通用生物系统安徽有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34