一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法技术

本发明专利技术公开了一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法。它的步骤如下：取成体饰纹姬蛙进行表面消毒；解剖取出腿肌用HBSS平衡盐溶液清洗；依次经胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶消化；组织悬液经切尖吸头和不切尖吸头吹打挤压后，依次经100μm孔径和40μm孔径细胞过滤网过滤制得细胞悬液；27℃恒温培养，每隔3‑4天换新的细胞完全培养基。本发明专利技术能快速、可重复地建立饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养，所需要的细胞培养设备简单，可操作性强。本发明专利技术是对已有的骨骼肌细胞的重要补充，为陆生适应性、变态发育、肌肉发育、肌肉损伤等重大生物学及医学问题提供了新的细胞材料。

A primary culture method for skeletal muscle cells of Rana decora

The invention discloses a primary culture method for skeletal muscle cells of Rana decora. Its steps are as follows: taking adult Agaricus ornamentalis frogs for surface disinfection; dissecting and removing leg muscles and cleaning them with HBSS balanced salt solution; digesting them by collagenase I and trypsin in turn; pressing tissue suspension by cutting suction head and non-cutting suction head, then filtering cells suspension with 100 and 40 micron pore sizes through cell filter mesh in turn; Incubate at constant temperature for 3 days and 4 days. The invention can quickly and repeatedly establish the primary culture of skeletal muscle cells of Agaricus ornamentatus, and the required cell culture equipment is simple and operable. The present invention is an important supplement to existing skeletal muscle cells, and provides new cell materials for major biological and medical problems such as terrestrial adaptability, metamorphosis, muscle development, muscle injury, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法
本专利技术属于动物细胞培养
，尤其涉及一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法。
技术介绍
1907年，哈里森(Harrison)采用悬滴培养法将蛙胚神经组织培养于淋巴液凝块中数周之久，并观察到从培养的组织块中长出了轴突，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。1913年，卡雷尔(Carrel)将外科手术中严格的无菌操作技术引入到动物细胞的体外培养中，使细胞在体外能够长期生长。1916年，劳斯(Rous)和琼斯(Jones)将胰蛋白酶消化法用于组织消化和细胞传代，标志着真正意义上的动物细胞培养的开始。1948年，厄尔(Earle)从小鼠的皮下组织分离并连续传代培养了第一种细胞系：L成纤维细胞系。2006年，山中伸弥(Yamanaka)诱导体外培养的小鼠成纤维细胞重编程为了诱导多能干细胞(iPSC)。随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技术中发挥着重要的作用。两栖动物，尤其无尾两栖类的细胞培养已经有一定的研究基础，从豹蛙(Ranapipiens)、中华大蟾蜍(Bufobufogargarizans)、金线侧褶蛙(Pelophylaxplancyi)、热带爪蟾(Xenopustropicalis)、特别是非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的胚胎，蝌蚪或成体中分离培养出了多种组织的原代细胞及细胞系(BallsandWorley1973；FreedandMezger-Freed1970；Sinzelleetal.2012；SmithandTata1991；吴政安,1978)。然而以上两栖动物细胞培养研究主要集中在动物细胞培养历史的早期阶段，自从上个世纪90年代以后就没有大的进展。动物细胞培养技术的研究近几十年主要集中于昆虫和哺乳动物,对两栖动物的关注较少。骨骼肌细胞(skeletalmusclecells)原代培养技术的研究主要集中于鼠和人，有少量兔、犬、鸡和非洲爪蟾的研究(ChargeandRudnicki2004；DanovizandYablonka-Reuveni2012；ParkerMHetal.2012；SheferandYablonka-Reuveni2008；Shibotaetal.2000；Yablonka-ReuveniandDay2011)。由于骨骼肌纤维已经失去了生长传代能力，因此通常取肌原性细胞(myogeniccell)进行培养以获得骨骼肌细胞，肌原性细胞主要为肌卫星细胞(skeletalmusclesatellitecell)，少量为成肌细胞(myoblast)。早期认为肌卫星细胞在体外培养不可避免地会进入终末分化状态，因此不可传代(Yablonka-ReuveniandDay2011)，近年发现加入P38抑制剂(SB203580)在人肌卫星细胞培养基中(Charvilleetal.2015)或加入四种细胞因子(IL-1α,IL-13,TNF-α和IFN-γ)在鼠肌卫星细胞培养基中(Fuetal.2015),可多次传代。部分由成肌细胞(myoblast)构建的细胞系可多次传代，如兔源L6和L8细胞系，鼠源C2，C2C12和MM14细胞系。两栖类来源培养的骨骼肌细胞无可传代报道。饰纹姬蛙(Microhylafissipes)隶属于两栖纲(Amphibia)无尾目(Anura)姬蛙科(Microhylidae)，分布于东亚及东南亚，种群数量甚多，具有体形小，生存能力强，物种稳定，个体差异小，雌雄较易分辨，产卵多，蝌蚪透明，一年多次产卵且繁殖期长，性成熟较快，卵直径较大(0.8-1.0毫米)(Feietal.,2009)，以及二倍体(Li,2006)等优点，使其在研究胚胎发育、适应性机制、人类疾病及环境健康等方面有着重要的价值(Liuetal.,2016)。此外，相对于水生生活的传统模式两栖动物爪蟾，饰纹姬蛙为陆生性物种，变态后主要在陆地上生活，可作为研究水生到陆生适应性的良好模型，以上特点表明饰纹姬蛙极具成为模式生物的潜力。个体水平的生理生化研究往往需要大量遗传背景一致、发育阶段相同的蛙，对饲养场地有严格的要求，工作量大，而若有离体培养的细胞则可精准方便的研究其相关功能及机制。饰纹姬蛙骨骼肌细胞的培养目前为空白。因此，通过本专利技术，建立饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法，是对已有的骨骼肌细胞的重要补充，两栖动物细胞培养的进一步发展，不仅能促进陆生适应性、变态发育、肌肉发育、肌肉损伤等重大生物学及医学问题的研究，还能增加我国细胞库的数量及种类，为日后其它两栖动物细胞系的建立提供借鉴经验。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法，为骨骼肌生理生化研究提供技术支持和保障。本专利技术通过以下技术方案完成：一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法，包括以下步骤：(1)配制溶液；(2)选取体重0.5-2.0克的成蛙冷冻麻醉，用75％酒精表面消毒；(3)将蛙置于平皿中，解剖；(4)剪取腿肌入新培养皿，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；(5)转移清洗好的腿肌入离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.0-1.5mL胶原酶Ⅰ溶液，27℃消化90分钟；(6)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7-15分钟，离心条件为：离心力500-800g，温度4-6℃；(7)小心吸出上清液并丢弃，加入1.0-1.5mL胰蛋白酶溶液，27℃消化15分钟；(8)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7-15分钟，离心条件为：离心力500-800g，温度4-6℃；(9)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；(10)用移液器(配1mL吸头，剪去吸头尖使尖头孔径约为2mm)用力缓慢吹打肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头，静置5分钟；(11)将约3/4体积上清液用100μm孔径细胞过滤网过滤；(12)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打剩余1/4体积肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头；(13)将剩余1/4体积肌肉组织悬液全部转移到100μm孔径细胞过滤网(见11)过滤；(14)滤液(见11，13)用40μm孔径细胞过滤网再过滤一次；(15)再加入1.0-4.0mL细胞完全培养基入40μm孔径细胞过滤网(见14)过滤；(16)将(14)(15)步得到的细胞悬液转移到细胞培养板中；(17)将细胞培养板置于培养箱内,27℃恒温培养；(18)每隔3-4天换细胞完全培养基。整个操作过程在无菌条件下进行，所有耗材、试剂均要求无菌。所述的HBSS平衡盐溶液浓度为标准HBSS平衡盐溶液的70％。所述的胶原酶Ⅰ溶液含胶原酶Ⅰ浓度为0.25％。所述的胰蛋白酶溶液含胰蛋白酶浓度为0.175％。所述的细胞完全培养基为LeibovitzL-15培养基、胎牛血清、Primocin和Y27632的混合物，pH值7.0-7.4。所述的细胞完全培养基中各成分含量为：标准LeibovitzL-15培养基60％，胎牛血清10％，纯水30％以及100μg/mlPrimocin和10μMY27632。本专利技术还涉及一种由上述培养方法获得的饰纹姬蛙骨骼肌细胞。本专利技术方法具有以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)配制溶液；(2)选取体重0.5‑2.0克的成蛙冷冻麻醉，用75％酒精表面消毒；(3)将蛙置于平皿中，解剖；(4)剪取腿肌入新培养皿，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；(5)转移清洗好的腿肌入离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.0‑1.5mL胶原酶Ⅰ溶液，27℃消化90分钟；(6)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7‑15分钟，离心条件为：离心力500‑800g，温度4‑6℃；(7)小心吸出上清液并丢弃，加入1.0‑1.5mL胰蛋白酶溶液，27℃消化15分钟；(8)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7‑15分钟，离心条件为：离心力500‑800g，温度4‑6℃；(9)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；(10)用移液器(配1mL吸头，剪去吸头尖使尖头孔径约为2mm)用力缓慢吹打肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头，静置5分钟；(11)将约3/4体积上清液用100μm孔径细胞过滤网过滤；(12)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打剩余1/4体积肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头；(13)将剩余1/4体积肌肉组织悬液全部转移到100μm孔径细胞过滤网(见11)过滤；(14)滤液(见11，13)用40μm孔径细胞过滤网再过滤一次；(15)再加入1.0‑4.0mL细胞完全培养基入40μm孔径细胞过滤网(见14)过滤；(16)将(14)(15)步得到的细胞悬液转移到细胞培养板中；(17)将细胞培养板置于培养箱内,27℃恒温培养；(18)每隔3‑4天换细胞完全培养基。整个操作过程在无菌条件下进行，所有耗材、试剂均要求无菌。...

【技术特征摘要】
1.一种饰纹姬蛙骨骼肌细胞的原代培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)配制溶液；(2)选取体重0.5-2.0克的成蛙冷冻麻醉，用75％酒精表面消毒；(3)将蛙置于平皿中，解剖；(4)剪取腿肌入新培养皿，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；(5)转移清洗好的腿肌入离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.0-1.5mL胶原酶Ⅰ溶液，27℃消化90分钟；(6)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7-15分钟，离心条件为：离心力500-800g，温度4-6℃；(7)小心吸出上清液并丢弃，加入1.0-1.5mL胰蛋白酶溶液，27℃消化15分钟；(8)将全部消化液(含未消化固体肌肉组织)离心7-15分钟，离心条件为：离心力500-800g，温度4-6℃；(9)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；(10)用移液器(配1mL吸头，剪去吸头尖使尖头孔径约为2mm)用力缓慢吹打肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头，静置5分钟；(11)将约3/4体积上清液用100μm孔径细胞过滤网过滤；(12)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打剩余1/4体积肌肉组织碎片，直到组织块能容易通过吸头；(13)将剩余1/4体积肌肉组织悬液全部转移...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘炯宇，江建平，常利明，刘露莎，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51