一种饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养方法技术

本发明专利技术公开了一种饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养方法。它的步骤如下：取成体饰纹姬蛙进行表面消毒；解剖取出肺脏用HBSS平衡盐溶液清洗；加入胶原酶Ⅰ溶液消化；消化液冷冻离心后加入细胞完全培养基；吹打肺组织碎片，并经100μm孔径细胞过滤网过滤制得细胞悬液；27℃恒温培养，每隔3‑4天换新的细胞完全培养基。本发明专利技术能快速、可重复地建立饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养，所需要的细胞培养设备简单，可操作性强，获得的细胞生长速度明显快于哺乳动物的肺泡上皮细胞。本发明专利技术是对已有的哺乳动物肺泡上皮细胞的重要补充，为陆生适应性、肺发育、肺纤维化、肺结核等重大生物学及医学问题的研究提供了新的细胞材料。

A primary culture method for alveolar epithelial cells of Rana decora

The invention discloses a primary culture method for alveolar epithelial cells of Rana decora. Its steps are as follows: taking adult Agaricus ornamentalis frogs for surface disinfection; dissecting lungs and cleaning them with HBSS equilibrium salt solution; adding collagenase I solution for digestion; freezing and centrifugation of digestive juice and adding complete cell culture medium; blowing pulmonary tissue fragments, and filtering through 100-micron pore cell filter to obtain cell suspension at 27 C; Every 3 days and 4 days, a new cell culture medium was replaced. The method can quickly and repeatedly establish the primary culture of alveolar epithelial cells of Agaricus ornamentalis. The required cell culture equipment is simple and operable, and the obtained cell growth rate is obviously faster than that of mammalian alveolar epithelial cells. The invention is an important supplement to the existing alveolar epithelial cells of mammals, and provides a new cell material for the study of major biological and medical problems such as terrestrial adaptability, lung development, pulmonary fibrosis, tuberculosis, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养方法
本专利技术属于动物细胞培养
，尤其涉及一种饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养方法。
技术介绍
1907年，哈里森(Harrison)采用悬滴培养法将蛙胚神经组织培养于淋巴液凝块中数周之久，并观察到从培养的组织块中长出了轴突，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养的基础。1913年，卡雷尔(Carrel)将外科手术中严格的无菌操作技术引入到动物细胞的体外培养中，使细胞在体外能够长期生长。1916年，劳斯(Rous)和琼斯(Jones)将胰蛋白酶消化法用于组织消化和细胞传代，标志着真正意义上的动物细胞培养的开始。1948年，厄尔(Earle)从小鼠的皮下组织分离并连续传代培养了第一种细胞系：L成纤维细胞系。2006年，山中伸弥(Yamanaka)诱导体外培养的小鼠成纤维细胞重编程为了诱导多能干细胞(iPSC)。随着基因工程和其他细胞工程技术的发展，细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其他许多技术的基础，在现代生物技术中发挥着重要的作用。两栖动物，尤其无尾两栖类的细胞培养已经有一定的研究基础，从豹蛙(Ranapipiens)、中华大蟾蜍(Bufobufogargarizans)、金线侧褶蛙(Pelophylaxplancyi)、热带爪蟾(Xenopustropicalis)、特别是非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的胚胎，蝌蚪或成体中分离培养出了多种组织的原代细胞及细胞系(BallsandWorley1973；FreedandMezger-Freed1970；Sinzelleetal.2012；SmithandTata1991；吴政安,1978)。然而以上两栖动物细胞培养研究主要集中在动物细胞培养历史的早期阶段，自从上个世纪90年代以后就没有大的进展。动物细胞培养技术的研究近几十年主要集中于哺乳动物和昆虫,对两栖动物的关注较少。肺泡上皮细胞(alveolarepithelialcells，AECcells)原代培养技术的研究主要集中于鼠，有少量兔、牛和人的研究(DobbsandGonzalez2002；GonzalezandDobbs2013)，吴政安(1978)培养过取样于中华大蟾蜍肺脏的细胞，但因未对所获细胞进行鉴定，因此细胞性质不明。通常认为肺泡上皮细胞不可传代，虽然有部分肺泡上皮细胞经转染方法建立了可传代的细胞系，但是传代后都失去了完整的肺泡上皮细胞的形态、生化和分子特性(DobbsandGonzalez2002；GonzalezandDobbs2013)，因此，采用肺泡上皮细胞为材料进行的研究一般仍使用未传代的原代细胞。饰纹姬蛙(Microhylafissipes)隶属于两栖纲(Amphibia)无尾目(Anura)姬蛙科(Microhylidae)，分布于东亚及东南亚，种群数量甚多，具有体形小，生存能力强，物种稳定，个体差异小，雌雄较易分辨，产卵多，蝌蚪透明，一年多次产卵且繁殖期长，性成熟较快，卵直径较大(0.8-1.0毫米)(Feietal.,2009)，以及二倍体(Li,2006)等优点，使其在研究胚胎发育、适应性机制、人类疾病及环境健康等方面有着重要的价值(Liuetal.,2016)。此外，相对于水生生活的传统模式两栖动物爪蟾，饰纹姬蛙为陆生性物种，变态后主要在陆地上生活，可作为研究水生和陆生适应性的良好模型，以上特点表明饰纹姬蛙极具成为模式生物的潜力。个体水平的生理生化研究往往需要大量遗传背景一致、发育阶段相同的蛙，对饲养场地有严格的要求，工作量大，而若有离体培养的细胞则可精准方便的研究其相关功能及机制。饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的培养目前为空白。因此，通过本专利技术，建立饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养方法，是对已有的哺乳动物肺泡上皮细胞的重要补充，两栖动物细胞培养的进一步发展，不仅能促进陆生适应性、肺发育、肺纤维化、肺结核等重大生物学及医学问题的研究，还能增加我国细胞库的数量及种类，为日后其它两栖动物细胞系的建立提供借鉴经验。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养方法，为肺生理生化研究提供技术支持和保障。本专利技术通过以下技术方案完成：一种饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养方法，包括以下步骤：(1)配制溶液；(2)选取体重0.5-2.0克的成蛙冷冻麻醉，用75％酒精表面消毒；(3)将蛙置于平皿中，解剖；(4)剪取肺脏入新培养皿，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；(5)转移清洗好的肺脏入离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.0-1.5mL胶原酶Ⅰ溶液，27℃消化4-5小时；(6)将全部消化液(含残余固体肺组织)离心7-15分钟，离心条件为：离心力500-800g，温度4-6℃；(7)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；(8)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打肺组织碎片，制得肺组织悬液；(9)肺组织悬液用100μm孔径细胞过滤网过滤；(10)再加入1.0-4.0mL细胞完全培养基入细胞过滤网过滤一次；(11)将(9)(10)步得到的细胞悬液转移到细胞培养板中；(12)将细胞培养板置于培养箱内,27℃恒温培养；(13)每隔3-4天换细胞完全培养基。整个操作过程在无菌条件下进行，所有耗材、试剂均要求无菌。所述的HBSS平衡盐溶液浓度为标准HBSS平衡盐溶液的70％。所述的胶原酶Ⅰ溶液含胶原酶Ⅰ浓度为0.25％。所述的细胞完全培养基为LeibovitzL-15培养基、胎牛血清、Primocin和Y27632的混合物，pH值7.0-7.4。所述的细胞完全培养基中各成分含量为：标准LeibovitzL-15培养基60％，胎牛血清10％，纯水30％以及100μg/mlPrimocin和10μMY27632。本专利技术还涉及一种由上述培养方法获得的饰纹姬蛙肺泡上皮细胞。本专利技术方法具有以下有益效果：1.运用单一酶消化法对细胞膜的损害程度轻，利于细胞存活。2.培养方法技术稳定，重复性好，培养条件简单，不需要二氧化碳培养箱，培养的细胞形态均一，生长良好。3.该细胞生长快速，第4天基本达到生长顶点，明显短于哺乳动物来源肺泡上皮细胞(一般10天左右)，可减少相关实验时间及试剂消耗。4.获得的细胞经显微镜观察、qPCR及细胞免疫化学鉴定具有典型的肺泡上皮细胞形态及特点，为进一步深入研究肺的陆生适应性、肺发育、肺纤维化、肺结核等重大生物学及医学问题提供了丰富的实验材料来源。附图说明图1是普通倒置相差显微镜(200×)下原代培养第1天饰纹姬蛙肺泡上皮细胞；图2是普通倒置相差显微镜(200×)下原代培养第4天饰纹姬蛙肺泡上皮细胞；图3是普通倒置相差显微镜(200×)下原代培养第7天饰纹姬蛙肺泡上皮细胞；图4是饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的qPCR鉴定，可见nkx2.1基因的相对表达量在本专利技术肺泡上皮细胞中远大于肌肉细胞和肾细胞；图5是荧光显微镜(400×)下饰纹姬蛙肺泡上皮细胞，可见核胞浆中出现蓝色的DAPI阳性荧光反应，肺泡上皮细胞浆Cytokeratin18抗原发绿色阳性荧光反应；图6是荧光显微镜(400×)下饰纹姬蛙肺泡上皮细胞，可见核胞浆中出现蓝色的DAPI阳性荧光反应，肺泡上皮细胞浆Cytokeratin本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)配制溶液；(2)选取体重0.5‑2.0克的成蛙冷冻麻醉，用75％酒精表面消毒；(3)将蛙置于平皿中，解剖；(4)剪取肺脏入新培养皿，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；(5)转移清洗好的肺脏入离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.0‑1.5mL胶原酶Ⅰ溶液，27℃消化4‑5小时；(6)将全部消化液(含残余固体肺组织)离心7‑15分钟，离心条件为：离心力500‑800g，温度4‑6℃；(7)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；(8)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打肺组织碎片，制得肺组织悬液；(9)肺组织悬液用100μm孔径细胞过滤网过滤；(10)再加入1.0‑4.0mL细胞完全培养基入细胞过滤网过滤一次；(11)将(9)(10)步得到的细胞悬液转移到细胞培养板中；(12)将细胞培养板置于培养箱内,27℃恒温培养；(13)每隔3‑4天换细胞完全培养基。整个操作过程在无菌条件下进行，所有耗材、试剂均要求无菌。

【技术特征摘要】
1.一种饰纹姬蛙肺泡上皮细胞的原代培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)配制溶液；(2)选取体重0.5-2.0克的成蛙冷冻麻醉，用75％酒精表面消毒；(3)将蛙置于平皿中，解剖；(4)剪取肺脏入新培养皿，用HBSS平衡盐溶液清洗3次；(5)转移清洗好的肺脏入离心管，吸走残余的HBSS平衡盐溶液，加入1.0-1.5mL胶原酶Ⅰ溶液，27℃消化4-5小时；(6)将全部消化液(含残余固体肺组织)离心7-15分钟，离心条件为：离心力500-800g，温度4-6℃；(7)小心吸出上清液并丢弃，然后加入1.0mL细胞完全培养基；(8)用移液器(配1mL吸头)缓慢反复吹打肺组织碎片，制得肺组织悬液；(9)肺组织悬液用100μm孔径细胞过滤网过滤；(10)再加入1.0-4.0mL细胞完全培养基入细胞过滤网过滤一次；(11)将(9)(10)步得...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘炯宇，江建平，常利明，刘露莎，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51