一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针制造技术

本发明专利技术公开了一种能够应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针。该探针以罗丹明B为荧光团，硫代双酰肼为响应基团，并在探针结构中引入吗啉结构作为溶酶体定位基团。在没有HOCl存在时，探针不发荧光；当HOCl存在时，探针在592nm处发出强的荧光。荧光强度随次氯酸浓度的增加而变强，在HOCl浓度为0‑2μM的范围内，荧光强度与次氯酸的浓度成线性增长。该探针具有高选择性，高灵敏度，响应快速的特点，并能应用于细胞溶酶体内HOCl的检测，具有广阔的运用前景。

A Luo Danming B fluorescent probe for detection of HOCl in cell lysosomes

The invention discloses a Luo Danming B fluorescent probe which can be applied to HOCl detection in cell lysosomes. Rhodamine B was used as the fluorescent group and thiodihydrazide as the response group. Morpholine structure was introduced into the probe structure as the lysosome localization group. In the absence of HOCl, the probe does not emit fluorescence; in the presence of HOCl, the probe emits strong fluorescence at 592 nm. The fluorescence intensity increases with the increase of hypochlorite concentration. The fluorescence intensity increases linearly with the concentration of hypochlorite in the range of 0_2_M of HOCl concentration. The probe has the characteristics of high selectivity, high sensitivity and fast response, and can be applied to the detection of HOCl in cell lysosome. It has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针
本专利技术涉及一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针，该探针能够检测细胞溶酶体内HOCl浓度的变化。
技术介绍
HOCl是生物体内重要的活性氧之一，在细胞的氧化还原平衡中有重要作用。当病原体侵入生物时，细胞会产生HOCl氧化杀死病原体；但细胞内次氯酸浓度过高时，会造成细胞功能异常，从而导致诸多疾病的发生，比如阿尔兹海默症，风湿性关节炎，癌症等。因此，实现细胞内HOCl的实时监测，对于生物体HOCl异常相关疾病的研究具有重要意义。相对于传统的分析方法，荧光探针具有灵敏性高、选择性好、响应快、操作简单、对细胞无损伤等优点，利用荧光探针检测HOCl的方法得到了快速发展。许多HOCl荧光探针已有文献报道。然而，大部分已经报道的次氯酸荧光探针并不具有细胞器靶向功能，这对研究细胞器水平HOCl的相关研究带来困难。此外，已报道的HOCl探针需要在较多有机溶剂体系中才能实现对HOCl的检测。而细胞内有机溶剂含量极低，因此，这些探针并不适用与细胞内HOCl的测试[ShenS.L.etal,Sens.ActuatorsB254(2018)736-741,ZhangY.R.etal,Sens.ActuatorsB240(2017)18-36]。基于此，专利技术人以罗丹明B为荧光团，以硫代双酰肼结构为HOCl响应基团，合成了一种对HOCl具有高灵敏度和高选择性的荧光探针。该探针具有优异的溶解性，可以在几乎为纯缓冲溶液体系中实现对HOCl的测定。此外探针结构中含有溶酶体定位基团—吗啉结构，探针可以应用于细胞溶酶体内HOCl的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针的制备及应用。本专利技术公开了一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针（RL1），其化学结构如下：本专利技术所述探针可以用于溶液中HOCl的检测，另外，该探针还可以用于细胞溶酶体内HOCl变化的检测及细胞成像。本专利技术的探针的合成方法，如图1所示。本专利技术的探针对HOCl具有很好的选择性。如图2所示。在没有HOCl存在时，该探针不发射荧光；当HOCl存在的情况下，本法明所述的探针发出592nm的荧光，而且荧光强度随次氯酸浓度的增加而变强，如图3所示。本专利技术所述的荧光探针，还可以用于RAW264.7细胞内HOCl的检测，如图4所示。本专利技术所述的探针能够靶向溶酶体，能实现溶酶体内HOCl的检测，如图5所示。附图说明图1是本专利技术探针的合成方法。图2是本专利技术探针的选择性分析。图3是本专利技术探针检测HCOl时荧光强度的变化。图4是本专利技术探针的响应时间曲线。图5是本专利技术探针应用于RAW264.7细胞内HOCl的检测。图6是本专利技术探针靶向溶酶体实验分析。具体实施方法实施例1：探针的合成路线见图1。将化合物1（2mmol）溶于10mLSOCl2中，加热回流2个小时后，减压除去溶剂，得固体2（未提纯，直接用于下一步反应）。将化合物2（2mmol）溶于10mL干燥吡啶中，常温搅拌约1小时，然后将化合物3（1mmol）加入反应体系，常温搅拌12小时。将反应液倒入150mL二氯甲烷中，然后用200mL水洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，再进行柱层析分离，得本专利技术所述探针RL1，白色固体，产率45%。以1HNMR、13CNMR及HRMS对其进行结构，数据如下：1HNMR(400MHz,d6-DMSO),δ(ppm):1.09(t,12H,J=6.8Hz,CH3),2.31(s,4H,CH2),3.30(q,8H,J=6.8Hz,CH2),3.46(s,2H,CH2),3.54(t,4H,J=4.0Hz,CH2),6.30-6.40(br,4H,ArH),6.44(d,2H,J=8.8Hz,ArH),7.13(d,1H,J=6.8Hz,ArH),7.32(d,2H,J=8.0Hz,ArH),7.55-7.70(m,4H,ArH),8.01(d,1H,J=6.8Hz,ArH),10.63(s,1H,ArH).13CNMR(100MHz,d6-DMSO),δ(ppm):164.1,153.2,148.5,141.8,135.9,132.9,131.3,129.6,128.7,128.4,127.7,124.3,123.7,107.6,103.30,97.0,66.1,61.9,53.1,43.6,12.4.HRMSm/z:calcdforC40H46N5O3S[M+H]+:676.3321;found:676.3317.实施例2：配制1μM探针的PBS缓冲溶液（含1%乙醇，pH5.00）。再分别加入下列离子，1:blank,2:Na+,3:K+,4:Ca2+,5:Mg2+,6:Zn2+,7:Al3+,8:Cu2+,9:Mn2+,10:Li+,11:Co2+,12:Hg2+,13:Pb2+,14:F-,15:Cl-,16:Br-,17:I-,18:AcO-,19:NO3-,20:NO2-,21:S2O32-,22:HCO3-,23:HPO42-,24:HS-,25:SO42-,26:Asn,27:Asp,28:Glu,29:Gly,30:Hcy,31:Ser,32:Trp,33:Cys,34:H2O2,35:t-BuOOH,36:t-BuO•,37:1O2,38:-O2,39:•OH,40:HOCl。Concentration:40µMfor(2)-(39);3µMfor(40)。通过荧光测试发现，只有在HOCl存在时，探针在592nm处才有荧光发射，而其他的离子并不能导致探针在592nm处荧光变化，因此本专利技术所述的探针对次氯酸具有好的选择性，如图2所示。实施例3：配制1μM探针的PBS缓冲溶液（含1%乙醇，pH5.00）。分别向上述缓冲溶液中加入0μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM的次氯酸，然后进行荧光光谱分析，结果显示探针在592nm处的荧光发射随着次氯酸浓度的增加而变强，如图3所示，图（a）为探针在不同浓度HOCl中荧光发射图，图(b)为探针在592nm处荧光强度与HOCl浓度的关系。实验结果表明，探针可以用于溶液中HOCl的检测。实施例4：配制1μM探针的PBS缓冲溶液（含1%乙醇，pH5.00）。对照组：测试样品在592nm处荧光强度随时间变化变化。实验组：向样品中加入3μMHOCl，记录样品在592nm处荧光强度随时间变化变化。实验结果表明，在加入HOCl时，探针在很短时间内对HOCl做出相应（小于10秒），因此探针具有优异的灵敏性，如图4所示。实施例5：在无血清培养基中加入1μM探针，培养RAW264.7细胞30分钟；分别用PBS洗3遍，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，结果见图5（a）上图所示，探针几乎不发出荧光。先使用1μg/mLLPS刺激RAW264.7细胞6小时，随后再加入1μg/mLPMA继续培养30分钟，随后在无血清培养基中加入1μM本专利技术所述探针RL1，培养30分钟；细胞分别用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.本专利技术提供一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针（RL1）的合成及应用，其化学结构如下。

【技术特征摘要】
1.本发明提供一种能应用于细胞溶酶体内HOCl检测的罗丹明B类荧光探针（RL1）的合成及应用，其化学结构如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：申世立，曹晓群，黄晓晴，
申请(专利权)人：泰山医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37