本发明专利技术涉及一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用。突变的海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。突变的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术首次根据(Pseudomonas stutzeri)Qlu3预测的三维结构为基础，对其活性中心进行关键氨基酸的定点突变，获得了海藻糖合酶的突变体蛋白，该突变的海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高，热稳定性好，较野生型海藻糖合酶，突变体的海藻糖转化率提高了4.5％，副产物葡萄糖的生成量降低了69.4％。
A mutant trehalose synthase and its expression genes and their applications
The invention relates to a mutant trehalose synthase and its expression gene and application. Mutated trehalose synthase expression gene, nucleotide sequence, as shown in SEQ ID NO.1. Mutation of trehalose synthase, amino acid sequence as shown in SEQ ID NO.2. Based on the three-dimensional structure predicted by Pseudomonas stutzeri Qlu3, the mutant protein of trehalose synthase was obtained by site-directed mutagenesis of key amino acids in its active center. The mutant trehalose synthase has the advantages of simple preparation method, high yield, high purity, good thermal stability, and is better than wild trehalose synthase. The trehalose conversion of the mutant was increased by 4.5% and the production of by-product glucose was reduced by 69.4%.
【技术实现步骤摘要】
一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用
本专利技术涉及一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用，属于基因工程
技术介绍
海藻糖是一种十分安全可靠的非还原性双糖，费雷德里克率先应用核磁共振技术对其化学结构进行了探究，有2个吡喃型葡萄糖单体通过1,1糖苷键连结而成的双糖。十九世纪上半叶由威格斯从一种黑麦的麦角菌中把海藻糖第一次提取获得，并且已经证实了海藻糖对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。又因为其耐干旱、抗低温、抗严寒等特性，被很多人称为“生命之糖”。海藻糖能使生物体忍受高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣的环境条件，原因是它能够产生一种膜附着在细胞表面，较好地维持蛋白分子不发生变性，进而使得动植物生命特性得以存在。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。因此海藻糖可广泛的应用到医药、化妆品业以及食品行业，具有诱人的开发应用前景和巨大的经济效益。鉴于海藻糖广泛而重要的应用价值，寻找海藻糖高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。目前海藻糖的生产方法主要有酵母提取法、发酵法、酶合成法。其中酶法生产海藻糖具有较高的特异性和快速温和等特点，已经成为研发海藻糖工业化生产的热点并作为短期可见效的可行性途径之一。海藻糖合酶(Trehalosesynthase,TreS)是一种分子内葡糖苷转移酶，它只需要一步反应就可以将麦芽糖的α-1,4糖苷键转化为α-1,1糖苷键生成海藻糖。该酶反应流程短，易调控，不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存，只需要一种酶一步反应就能获得海藻糖，因此海藻糖合酶转化法是适宜工业化生产海藻糖的方法，有着良好的应用前景，受到广泛的关注。到目前为止，国内外有报道的能够产海藻糖合酶的微生物已经超过15种。不同微生物来源的海藻糖合酶的催化效率、酶学性质各有不同，但其在反应过程中均伴有副产物的产生，有的高达20％，一般为5％-10％左右，这对下游产物的分离纯化带来了难度，同时提高了海藻糖的生产成本。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种突变的海藻糖合酶及其表达基因与应用。该突变的海藻糖合酶副产物葡萄糖的生成量降低，海藻糖的转化率提高。该海藻糖合酶由来源于施氏假单胞菌(PseudomonasstutzeriQlu3)的海藻糖合酶经定点突变A309E获得。本专利技术技术方案如下：一种突变的海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。一种突变的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术所述海藻糖合酶是通过Quickchange定点突变的方法对关键氨基酸309位的丙氨酸突变为谷氨酸，然后转入大肠杆菌进行高效表达后，利用镍柱亲和层析，离子交换层析，分子筛等一系列纯化手段，最终获得高纯度的海藻糖合酶突变体蛋白。上述重组蛋白反应2h即可达到最大转化率，海藻糖转化率即可达到74.7％，副产物仅为1.1％。上述重组蛋白在50℃金属浴中放置30min海藻糖转化率依然可以达到51.2％。上述重组蛋白最适反应温度为35℃。上述重组蛋白最适反应pH为7.0-8.0。一种插入上述突变的海藻糖合酶的表达基因的重组载体。一种转基因细胞系，含有上述重组载体。上述突变的海藻糖合酶的表达基因、重组载体或转基因细胞系在制备海藻糖合酶中的应用。上述突变的海藻糖合酶在制备海藻糖中的应用。本专利技术所述的海藻糖合酶，由施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)Qlu3中获得，具体方法为：对商品化的pET-15b载体的多克隆位点进行改造，删除掉多余的酶切位点，保留BamHI,XhoI,EcolI,HindIII酶切位点，并在其中加入了Prescission酶切位点，获得pGLO1载体。将该基因连接到pGLO1载体上构建成质粒，然后利用Quickchange定点突变的方法对关键氨基酸309位的丙氨酸(A)突变谷氨酸(E)，并转化到大肠杆菌BL21DE(3)中进行原核表达。然后通过镍柱亲和层析，Source-Q离子交换层析，Superdex-200分子筛层析的方法分离获得高纯度的突变体海藻糖合酶。有益效果本专利技术首次根据(Pseudomonasstutzeri)Qlu3预测的三维结构为基础，对其活性中心进行关键氨基酸的定点突变，获得了海藻糖合酶的突变体蛋白，该突变的海藻糖合酶制备方法简便，产量大，纯度高，热稳定性好，并且海藻糖转化率由野生型的71.5％提高到74.7％，副产物由野生型的3.6％降低至1.1％，较野生型海藻糖合酶，突变体的海藻糖转化率提高了4.5％，副产物葡萄糖的生成量降低了69.4％。可以降低海藻糖与葡萄糖的分离成本，为海藻糖的工业化生产奠定了基础；也为其他相似蛋白提高转化率提供了可行性方法。附图说明图1是PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳结果照片；图中：M、Marker，T为TreS-pET-15b的目的条带；图2为镍柱纯化后海藻糖合酶SDS-PAGE电泳结果图片；图中，ce：破碎后全菌液，s：高速离心后上清，elu：镍柱洗脱后蛋白；图3为通过高效液相测定的葡萄糖、麦芽糖和海藻糖的标样峰状结果图；图4为通过高效液相测定反应结束后葡萄糖、海藻糖和麦芽糖的峰状结果图；图5A为纯化后海藻糖合酶酶活最适反应温度曲线图；图5B纯化后海藻糖合酶酶活温度稳定曲线图；图6A为纯化后海藻糖合酶最适反应pH曲线图；图6B纯化后海藻糖合酶pH稳定曲线图；图7A为纯化后海藻糖合酶与突变体反应时间对海藻糖转化率影响的曲线图；图中：TreS为野生型海藻糖合酶，TreSA309E为突变的海藻糖合酶；图7B为纯化后海藻糖合酶与突变体反应时间对葡萄糖转化率影响的曲线图；图中：TreS为野生型海藻糖合酶，TreSA309E为突变的海藻糖合酶。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步阐述，但本专利技术所保护范围不限于此。实施例1：克隆得到突变的海藻糖合酶基因。依据NCBI上公开的施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)海藻糖合酶全长核苷酸序列设计突变点处的引物，引物序列如下：上游引物：GTGGCCCTCCGACCAttcGGTGCC下游引物：CGTGCCGAGGGCACCgaaTGGTCG以构建好的tres-pGLO1质粒为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：上述PCR反应按照如下程序进行：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸4min，25个循环；72℃终延伸10min。PCR结束后通过1wt％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短。实施例2：将突变的海藻糖合酶基因转化到表达宿主中，获得阳性表达菌株。PCR产物经DpnI内切酶酶切反应，酶切反应体系如下：PCR产物的酶切体系：充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，37℃连接反应30min。重组质粒的转化(1)感受态细胞的制备①挑取大肠杆菌BL21(DE3)(购自上海前尘生物科技有限公司)单菌落(或挑取保存菌种)接种至10ml液体LB培养基中，37℃，210rpm过夜培养；②取5ml菌液接种于500mlLB培养基中，37℃，210rpm，摇70-8本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种突变的海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种突变的海藻糖合酶的表达基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种突变的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种重组载体，表达载体中插入了权利要求1所述的表达基因。4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述表达载体为...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏静，李珍珍，王瑞明，张云霄，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。