基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法及专用引物技术

本发明专利技术公开了一种基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法及专用引物，本发明专利技术根据与大麦Yd2基因紧密连锁的2个标记设计出2对特异引物对(SEQ ID No.1～4)，建立了一种双重PCR检测方法，一次双重PCR可同时检测双标记位点，可快速准确地判定任何世代大麦个体的Yd2基因型。杂交育种F2～Fn世代中，仅在F2代中检测筛选出152bp+100bp带型的个体，就可得到抗性纯合个体(Yd2

Molecular marker assisted selection and specific primers for barley yellow dwarf resistance gene Yd2 based on double PCR

The invention discloses a method for marker-assisted selection of barley yellow dwarf resistance gene Yd2 based on double-PCR and a special primer. According to two markers closely linked to barley Yd2 gene, two pairs of specific primer pairs (SEQ ID No.1-4) are designed, and a double-PCR detection method is established. A single double-PCR method can be simultaneously detected. Double marker loci can quickly and accurately determine the Yd2 genotype of any generation of barley individuals. In F2-Fn generation of hybrid breeding, only 152 bp+100 BP band type individuals were screened out from F2 generation, and resistant homozygous individuals (Yd2) could be obtained.

【技术实现步骤摘要】
基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法及专用引物
本专利技术涉及农作物抗病分子育种
，具体涉及基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法及专用引物。
技术介绍
黄矮病是由蚜虫传播的大麦黄矮病毒(barleyyellowdwarfvirus，简称BYDV)侵染所引起的一种全球性的主要麦类病毒病害。染病后主要表现为叶片黄化、植株矮化、产量减少、品质下降等症状。因而，该病有“黄色瘟疫”之称。全球麦类产区因该病造成的年均损失为11～33％，有些地区甚至高达86％。选育抗病品种是防治该病最经济、安全、有效的途径。然而，麦类中抗病基因贫乏，仅在埃塞俄比亚大麦种质中发现的Yd2基因对黄矮病具有高而持久的抗性。Yd2基因是世界上迄今发现的最优异的抗黄矮病基因。目前，国外已经成功地将Yd2基因导入了主栽大麦中，培育出了一些抗病品种。尽管如此，Yd2基因在育种实践中仍没有得到充分利用。Yd2基因抗性育种所面临的一个最大挑战是育种分离世代中携带Yd2基因个体的筛选十分困难。常规的生物学抗性检测非常繁琐，而且也很难准确地鉴定其抗性水平以及判断Yd2基因的有无，这就极大地限制了Yd2基因在大麦抗病育种中的广泛应用。Yd2基因属于不完全显性，纯合时高抗，杂合时其抗性则随遗传背景的差异而不同，可能高抗，也可能感病。然而，在育种分离世代中往往是对杂合个体的筛选，这使得Yd2基因的育种筛选更加困难。如果采用DNA分子标记辅助选择的方法可直接在各育种分离世代的大麦幼苗期对Yd2基因进行鉴定与筛选，能够克服上述局限，可极大地提高抗性育种的效率，有利于Yd2基因在抗病育种实践中的广泛应用。若要对大麦Yd2基因进行分子标记辅助育种选择，筛选到与Yd2基因紧密连锁的标记则是其重要前提。Paltridege等(1998)在大麦第3条染色体上找到了1个与Yd2基因紧密连锁(0.7cM)的共显性标记YLM，该标记能用于检测Yd2基因的有无，也能鉴别Yd2基因型，且操作简单，成本低，但准确度却不够高，存在一定的选择偏差与风险。Ford等(1999)也在大麦中找到了1个与Yd2基因几乎处于共分离的标记CAPS-YLP(＜0.3cM)，该标记为共显性标记，检测Yd2基因的准确度很高，且能识别Yd2基因型，但因其属于CAPS标记，需要PCR扩增后，再进行1次酶切才能完成检测，操作繁琐，成本高，不适合大规模分子标记辅助育种选择。鉴于此，Ford等(1999)又基于该YLP标记位点将其改造成1个仅需一步PCR就可完成的显性标记ASPCR-YLP，操作简化了，而且能准确地鉴定Yd2基因的有无，但却不能鉴别Yd2基因型了。另外，作为显性标记，ASPCR-YLP是通过1条268bp电泳条带的有无来判断大麦是否携带Yd2基因。然而，那些PCR扩增失败的大麦材料往往会被误判为是不携带Yd2基因的材料。由此可见，以上涉及的来自2个标记位点(YLM位点和YLP位点)的3种标记(YLM、CAPS-YLP和ASPCR-YLP)各自存在着优缺点。迄今为止，它们仍然是大麦中已发现的离Yd2基因最近的标记。曾有人在大麦抗黄矮病育种中利用这些标记来进行Yd2基因的单标记辅助选择，已取得了一定的成效，但均因其各自缺点，最终都没有被作为理想的分子标记在大规模的分子标记辅助育种中加以广泛利用。赵彦宏等(2001)发现这3种标记检测方法存在互补性，将这3种单标记检测配合起来同时考察这2个标记位点，可取长补短，相互验证，提高准确性。然而，采用单标记检测来考察2个标记位点基因型，至少需要2次PCR扩增检测才能完成，这显然不利于大规模的分子标记辅助育种选择。一般认为，最理想的分子标记辅助育种选择方法应该同时符合如下几个特点：(1)鉴定与筛选目标基因的准确性高(这要求所用标记与目标基因遗传距离非常近)；(2)所用标记最好为共显性标记，既能鉴定目标基因的有无，同时还能判定其基因型；(3)操作简单、快速有效，而且成本较低；(4)适合大规模的育种选择。显然，现有的大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法并不完全符合理想分子标记辅助选择的特点。正因如此，迄今为止，尚未有十分理想的适合大规模抗病育种选择Yd2基因的分子标记辅助选择方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种与大麦Yd2基因紧密连锁的分子标记引物——两对特异引物对MYM和MYP，利用双重PCR技术能够同时检测双标记位点，不仅能准确检测Yd2基因的有无，而且也能直接判定其基因型。本专利技术的另一目的是提供一种利用双重PCR技术对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法，该方法能够在大麦抗黄矮病育种中准确、快速、简单、有效地筛选出抗病材料。为实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：本专利技术根据与大麦Yd2基因紧密连锁的2个分子标记(YLM与ASPCR-YLP)信息，首先重新设计了引物，并对这2个标记进行了改造(经改造后的标记改称为MYM标记和MYP标记)，然后建立了一种通过一次PCR反应就可同时检测双标记位点的双重PCR检测方法。利用该检测方法，可简单、快速、准确地鉴定任何世代大麦个体中Yd2基因的有无，同时也能鉴定其Yd2基因型。基于该双重PCR检测方法，进而发展出了一种大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法。具体如下：其中，引物对MYM的正向引物序列如SEQIDNo.1所示，其反向引物序列如SEQIDNo.2所示，引物对MYP的正向引物序列如SEQIDNo.3所示，其反向引物序列如SEQIDNo.4所示。其中，利用双重PCR技术对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法，具体步骤如下：(1)提取待检测大麦各育种世代材料的基因组DNA；将大麦抗黄矮病育种分离世代材料的种子，播种；待幼苗长到4～6片叶之后，每株取1片幼叶，可以采用采用改良的CTAB法或简易快速NaOH提取方法提取大麦基因组DNA，并且方法不限于此，凡是能将基因组DNA提取的方法均可。其中简易快速NaOH提取方法(见WangH，etal.1993.AsimplemethodofpreparingplantsamplesforPCR.NuclAcidsRes，21：4153-4154)更适合大规模育种筛选，其主要步骤为：取少量新鲜大麦叶片放入研钵中，每毫克叶片加入10μLNaOH(0.5mmol/L)，然后研磨制成匀浆；用10倍体积的Tris-HCl(0.1mmol/L，pH8.0)稀释，离心后吸取上清，获得DNA粗提液，保存备用。(2)以待测大麦材料的基因组DNA为模板(也可以用上面的简易快速NaOH提取方法获得DNA粗提液作为模板)，利用与大麦Yd2基因紧密连锁的2个分子标记序列，设计出的2对特异引物(SEQIDNo.1～SEQIDNo.4)，进行双重PCR扩增与电泳检测；①双重PCR扩增所用的2对特异引物序列为：MYM-F：5′-GGAGAACAGGAGCTGGTGAA-3′(SEQIDNo.1)MYM-R：5′-AAATTTAAAGGGCTCCGTGA-3′(SEQIDNo.2)MYP-F：5′-ATATACAGGGGCTTGCTTCG-3′(SEQIDNo.3)MYP-R：5′-TGGTCAACTAGTATCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择专用引物，其特征在于，所述引物为两对特异引物对MYM和MYP，引物对MYM的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，其反向引物序列如SEQ ID No.2所示，引物对MYP的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，其反向引物序列如SEQ ID No.4所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择专用引物，其特征在于，所述引物为两对特异引物对MYM和MYP，引物对MYM的正向引物序列如SEQIDNo.1所示，其反向引物序列如SEQIDNo.2所示，引物对MYP的正向引物序列如SEQIDNo.3所示，其反向引物序列如SEQIDNo.4所示。2.一种基于双重PCR对大麦抗黄矮病基因Yd2的分子标记辅助选择方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提取待检测大麦各育种世代材料的基因组DNA；(2)以待测大麦材料的基因组DNA为模板，利用与大麦Yd2基因紧密连锁的2个分子标记设计出的2对特异引物对MYM和MYP，进行双重PCR扩增与电泳检测；(3)根据双重PCR产物电泳检测结果中152bp、100bp、111bp三种条带的出现情况，判定大麦材料是否携带Yd2基因，并直接确定其Yd2基因型；(4)按照步骤(1)～(3)的方法检测育种分离世代个体后，根据判定的Yd2基因型结果对其各世代分离群体加以选择。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述双重PCR扩增的反应体系为：扩增反应总体积为10μL，含20～50ng大麦模板DNA或者DNA粗提液，1×PCRbuffer，0.24mmolL-1dNTP，1.5mmolL-1MgCl2，1.5UTaqDNA聚合酶，MYP标记上下游引物各0.2μmolL-1，MYM标记上下游引物各0.6μmolL-1；所述双重PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；最后总延伸5min，4℃保温。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述双重PCR扩增所用引物对的浓度比例为：MYP引物对/MYM引物对＝1/3。5.根据权利要求2所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵彦宏，王艳芳，李润植，薛金爱，刘林德，
申请(专利权)人：鲁东大学，山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37