一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记及其获得方法和应用技术

技术编号:19357870 阅读:19 留言:0更新日期:2018-11-07 20:28
本发明专利技术涉及一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记及其获得方法和应用,利用细胞质雄性不育系材料YJ15和恢复系材料XJ07构建了F2分离群体HS;同时,用YJ15和恢复系材料XJ02构建了另一个F2分离群体BL。采用极端混池结合RNA‑Seq及重组单株分析法对HS群体进行恢复基因定位,最终获得与恢复基因紧密连锁的染色体区域和候选基因,进一步根据候选基因附近的变异设计分子标记CaML。采用该标记对HS群体进行鉴定,符合率达到100%,用该标记对BL群体进行鉴定,符合率达到93.2%。本发明专利技术为辣椒细胞质雄性不育恢复基因的克隆和相关育种工作提供了紧密连锁的分子标记,具有重要的利用价值。

A Molecular Marker Closely Linked to Recovery Gene of Cytoplasmic Male Sterility in Pepper and Its Acquisition Method and Application

The present invention relates to a molecular marker closely linked to restorer gene of cytoplasmic male sterility in pepper and its acquisition method and application. F2 isolation population HS was constructed by using cytoplasmic male sterile line material YJ15 and restorer line material XJ07, and another F2 isolation population BL was constructed by using YJ15 and restorer line material XJ02. Extreme mixing pool, RNA Seq and recombinant single plant analysis were used to locate the restorer genes in HS population. Finally, chromosome regions and candidate genes closely linked to the restorer genes were obtained, and molecular marker CaML was designed according to the variation near the candidate genes. The coincidence rate of HS population was 100% and BL population was 93.2% by using this marker. The present invention provides a closely linked molecular marker for the cloning of restorer gene of cytoplasmic male sterility in pepper and related breeding work, and has important utilization value.

【技术实现步骤摘要】
一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记及其获得方法和应用
本专利技术属于辣椒遗传育种和分子生物学领域,具体涉及一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记及其获得方法和应用。
技术介绍
辣椒(CapsicumannuumL.)为茄科辣椒属一年生或多年生植物,在全球范围内广泛种植,是一类重要的蔬菜作物。辣椒起源于南美洲,其人工驯化和栽培历史超过6000年。大约于明朝后期(16世纪),辣椒传入我国。现已成为我国尤其是长江流域一带人民日常食谱的重要组成部分。如何高效选育高产优质辣椒品种一直以来备受辣椒育种工作者的关注,我国当前辣椒育种仍以基于田间表型选择的传统育种方式为主,现代化的分子育种水平还比较低。近年来,辣椒基因组学研究取得重要进展,特别是Zunla和CM334全基因组序列的释放,为辣椒分子标记的开发及其在遗传育种中的应用提供了便利。细胞质雄性不育(CMS)是广泛存在于高等植物中的一种自然现象,表现为雌蕊正常但是花粉败育,是一种母系遗传现象。目前细胞质雄性不育系已被应用于辣椒三系育种中,以不育系为母本、恢复系为父本杂交得到杂种一代;以不育系为母本、保持系为父本可以得到纯种的不育系种子以保持不育系的繁殖。这种制种方法省去了繁重的去雄工作,大大提高了制种效率,同时保证了杂种一代种子的纯度。然而,辣椒细胞质雄性不育育性恢复方面目前还没有一个很可靠的候选基因。在以往的研究探索中,研究人员陆续开发了一些RAPD和AFLP标记,如OPP13-CAPS、AFRF8-CAPS、PR-CAPS和CRF-SCAR(Leeetal2008;Kimetal2006;Gulyasetal2006),但这些标记在实际的生产应用过程中表现并不理想。最近辣椒CMS恢复基因的研究中,定位了一段与辣椒育性恢复共分离的基因组片段,并将一个PPR类型的基因CaPPR6作为候选基因,进一步开发了相关的分子标记。但是,当把这些标记运用于育种过程中时,标记的基因型并不能很好地与表型相符合(Haetal2017)。此外,由于细胞质不育源可能不同,其恢复基因也可能不同,标记的通用性受制于不育源。目前,辣椒育种主要仍然采用常规手段。传统的育种手段存在费时、费工、准确性差并且易受环境因素影响等弊端。而基于分子标记辅助选择(MarkerAssistedSelection,MAS)技术的分子标记辅助育种,利用分子标记与目标性状基因紧密连锁的特点,通过检测连锁的分子标记,即可判断目标基因的存在和状态,达到选择目标性状的目的,具有检测时期早、检测速度快、结果准确并且不受环境条件干扰的优点,因而得到广大育种家的青睐。目前辣椒育种中仍然缺乏可靠的细胞质雄性不育育性恢复基因标记,基于此,做出本申请。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML及其获得方法和应用。本专利技术的分子标记可用于辣椒细胞质雄性不育育性恢复性鉴定。利用本专利技术的分子标记可以有效区分辣椒材料中是否含有CMS的恢复基因,结合三系育种策略可高效创制辣椒新品种,还为克隆辣椒CMS育性恢复基因进而解析育性恢复的分子机理奠定重要基础。为了实现本专利技术上述第一个目的,本专利技术提供了一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML,所述分子标记是由与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的SNP位点设计的基因分型引物转化而来。进一步地,上述技术方案中所述的引物包含正向引物CaML-F和反向引物CaML-R,正反向引物分别如下:正向引物CaML-F:5’-TGGCCTTGCAATCCGTTATG-3’,(SEQIDNO.1);反向引物CaML-R:5’-TGCTAGTGTTACGGGTATGCTC-3’,(SEQIDNO.2)。本专利技术的第二个目的在于提供上述所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML的获得方法,所述方法包括如下步骤:(1)以细胞质雄性不育系材料YJ15为母本,恢复系材料XJ02和XJ07为父本,分别构建F2分离群体BL和HS;(2)F2群体种植在塑料大棚内,外覆防虫网,按照辣椒标准化生产模式管理,通过对F2植株坐果、花器官和花粉活力鉴定,确定植株的育性;选取可育植株和不育植株各30株,分别采集即将开放且大小相对一致的花蕾混合作为极端池,使用植物RNA快速提取试剂盒TRIzol提取辣椒RNA并送测序公司在HISeq4000测序平台进行双端150bp测序;(3)获得混池+RNA-Seq(BSR)数据后,利用FastQC软件对测序数据质量进行评估,使用Trimmomatic去除接头、低质量和含N较多的reads,对测序数据进行质量控制;然后使用hisat2将各reads比对到辣椒参考基因组(Zunla_V2),获得的比对文件数据利用samtools软件以及自主开发的Perl脚本提取多态性SNP,并且计算隐性池的最大等位基因型频率(SNP-index),以及该基因型在显性池的频率,进一步计算每个SNP位点的欧几里得距离(ED值);过滤掉两池测序深度都低于15个reads以及SNP-index都大于0.7的位点,最后对ED值取幂次方后进行线性回归拟合并作图,以所有位点幂次方拟合值的中位值及标准差之和的3倍作为阈值线,高于阈值线的区段作为候选区间;(4)利用CTAB法提取不育系YJ15和恢复系XJ07的DNA在HISeq4000测序平台进行重测序,进一步利用XJ07和YJ15的重测序数据进行标记开发和基因定位;(5)根据BSR和重测序的结果,开发相关分子标记进行精细定位,获得恢复基因的候选基因CaML以及一个与其紧密连锁的SNP位点,针对该SNP,利用NCBI的Primer-BLAST设计引物,将该SNP转化为CAPS标记。进一步地,上述技术方案中所述的引物包含正向引物CaML-F和反向引物CaML-R,正反向引物分别如下:正向引物CaML-F:5’-TGGCCTTGCAATCCGTTATG-3’;反向引物CaML-R:5’-TGCTAGTGTTACGGGTATGCTC-3’。本专利技术的第三个目的在于提供上述所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML的应用,可用于辣椒育性恢复性的鉴定。进一步地,上述技术方案中所述的鉴定方法具体包括如下步骤:(1)提取辣椒单株的DNA并作为模板;(2)采用分子标记CaML进行PCR扩增,其正向引物序列为SEQIDNO.1,反向引物序列为SEQIDNO.2;(3)对步骤(2)所得PCR扩增产物进行限制性内切酶(BcuI)酶切;(4)利用1%琼脂糖凝胶对步骤(3)所得酶切产物进行凝胶电泳,出现不同带型;(5)检测步骤(4)所得带型,如果出现的是单带时,可判定辣椒植株为不含恢复基因的(不育)植株;如果出现双带时,可判定辣椒植株为含有纯合恢复基因的(可育)植株;如果出现三带时,可判定辣椒植株为含有恢复基因的杂合(可育)植株。进一步地,上述技术方案步骤(2)中所述的PCR扩增反应体系,按总体积为15μl计,包括如下各组分:ddH2O10.4μl,10×PCRBuffer1.5μl,1.2μldNTPs(2mmol/L),0.08μlTaqDNA聚合酶(5U/μl),0.4μl正向引物(本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML,其特征在于:所述分子标记是由与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的SNP位点设计的基因分型引物转化而来。

【技术特征摘要】
1.一种与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML,其特征在于:所述分子标记是由与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的SNP位点设计的基因分型引物转化而来。2.根据权利要求1所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML,其特征在于:所述的引物包含正向引物CaML-F和反向引物CaML-R,正反向引物分别如下:正向引物CaML-F:5’-TGGCCTTGCAATCCGTTATG-3’,(SEQIDNO.1);反向引物CaML-R:5’-TGCTAGTGTTACGGGTATGCTC-3’,(SEQIDNO.2)。3.权利要求1所述的与辣椒细胞质雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记CaML的获得方法,其特征在于:所述方法包括如下步骤:(1)以细胞质雄性不育系材料YJ15为母本,恢复系材料XJ02和XJ07为父本,分别构建F2分离群体BL和HS;(2)F2群体种植在塑料大棚内,外覆防虫网,按照辣椒标准化生产模式管理,通过对F2植株坐果、花器官和花粉活力鉴定,确定植株的育性;选取可育植株和不育植株各30株,分别采集即将开放且大小相对一致的花蕾混合作为极端池,使用植物RNA快速提取试剂盒TRIzol提取辣椒RNA并送测序公司在HISeq4000测序平台进行双端150bp测序;(3)获得混池+RNA-Seq(BSR)数据后,利用FastQC软件对测序数据质量进行评估,使用Trimmomatic去除接头、低质量和含N较多的reads,对测序数据进行质量控制;然后使用hisat2将各reads比对到辣椒参考基因组Zunla_V2,获得的比对文件数据利用samtools软件以及自主开发的Perl脚本提取多态性SNP,并且计算隐性池的最大等位基因型频率,以及该基因型在显性池的频率,进一步计算每个SNP位点的欧几里得距离(ED)值;过滤掉两池测序深度都低于15个reads以及SNP-index都大于0.7的位点,最后对ED值取幂次方后进行线性回归拟合并作图,以所有位点幂次方拟合值的中位值及标准差之和的3倍作为阈值线,高于阈值线的区段作为候选区间;(4)利用CTAB法提取不育系YJ15和恢复系XJ07的DNA在HISeq4000测序平台进行重测序,进一步利用XJ07和YJ15的重测序数据进行标记开发和基因定位;(5)根据BSR和重测序的结果,开发相关分子标记进行精细定位,获得恢复基因的候选基因CaML以及一个与其紧密连锁的SNP位点,针对该SNP,利用NCBI的Primer-BLAST设计引物,将该SNP...

【专利技术属性】
技术研发人员:欧阳波贾全锐于会洋周玉红刘峰陈文超李峰邹学校
申请(专利权)人:华中农业大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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