一种用于检测布氏菌的荧光定量重组酶聚合酶扩增方法技术

本发明专利技术提供通用型布氏菌的荧光定量RPA快速检测方法，本发明专利技术引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：20min即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为10个拷贝；2)特异性强：采用PRA引物组和荧光探针特异性对布氏菌进行检测，与常见非布氏菌株无交叉反应；3)操作简便：配置好的RPA反应体系，设置好反应程序，置于荧光定量PCR仪或RPA反应仪中。4)高通量：可一次性进行大量样品检测，结果判定与统计由程序自动完成。

A fluorescence quantitative polymerase chain reaction amplification method for detection of Brucella

The invention provides a rapid detection method of general Brucella by fluorescence quantitative RPA. The advantages of the primers and methods are as follows: 1) high efficiency and sensitivity: the amplification can be completed in 20 minutes, and the minimum detection limit of the amplification template is 10 copies; 2) strong specificity: the detection of Brucella by using PRA primers and fluorescence probe specificity is normal. There was no cross-reaction among non-Brucella strains. 3) It was easy to operate: the RPA reaction system was set up, the reaction procedure was set up, and placed in the fluorescence quantitative PCR or RPA reactor. 4) high throughput: a large number of samples can be detected at once, and the results are automatically completed by the program.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测布氏菌的荧光定量重组酶聚合酶扩增方法
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，RPA)进行布氏菌荧光定量快速检测方法。
技术介绍
布氏菌病(简称布病)是由布氏菌引起的人兽共患病，近年来该病在我国呈扩散趋势，给畜牧业造成了重大损失并严重威胁公共卫生安全。布氏菌可感染猪、牛、羊、犬、鼠等多种哺乳动物，其中对公共卫生和畜牧业影响严重的为牛种布氏菌、羊种布氏菌、猪种布氏菌、绵羊附睾种布氏菌、犬种布氏菌和沙林鼠种布氏菌6种经典种型。布氏菌病主要危害动物的生产性能，公畜出现睾丸炎、附睾炎、精囊坏死等症状，患病母畜出现胎盘炎、乳房炎、流产、不孕不育等症状。人类由于接触布氏菌污染的环境、患病动物分泌物、尸体及产品而感染发病，患者病情反复不易彻底治愈，出现乏力、发热、盗汗、关节酸痛等症状，严重者丧失劳动能力。因此，实现布氏菌的快速检测，对该病的诊断、防控及净化具有重要意义，从而降低该病造成的损失以及公共卫生风险。RPA是近年新开发的恒温核酸扩增技术，该技术在36～40℃恒温条件下，通过重组酶、聚合酶和单链DNA结合蛋白的作用，在20min内实现目的基因的大量扩增，具有特异性强、灵敏度高、反应速度快、操作简便等优点，并且反应仪器简单便携。根据反应原理和使用探针的差异，RPA分为普通RPA、exo-RPA、nfo-RPA和fpg-RPA，反应结果可通过琼脂糖凝胶电泳、荧光定量扩增曲线和LFD测流层析试纸条进行判定，因此在设计RPA检测方法时应根据需求设计相应的引物和探针。exo-RPA、nfo-RPA和fpg-RPA方法都可以通过荧光定量扩增曲线法判定结果，可实现样品的快速高通量检测，适用于检验检疫和流行病学调查；此外，nfo-RPA方法还可通过LFD试纸条读取检测结果，适用于野外及现场快速检测。洪彬等申请了一种用于现场快速检测布鲁氏菌的通用RPA方法及其配套试剂盒(申请号201510293311.6)，该方法采用LFD测流层析试纸检测试验结果，反应完成后人工观察并判定检测结果。HangRen等(Ren，Y.Z.,etal.,DevelopmentofarapidrecombinasepolymeraseamplificationassayfordetectionofBrucellainbloodsamples.MolecularandCellularProbes,2016.20:p.122.)公开了一种基于RPA方法建立的用于检测血液样品中布氏菌的荧光定量RPA方法。该方法扩增并检测的目的基因为Omp31蛋白编码基因，但该基因已经被证实在牛种布氏菌基因组中缺失，因此该方法不适用于牛种布氏菌的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供通用型布氏菌的荧光定量RPA快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供用于检测布氏菌的荧光定量RPA引物组和荧光探针，引物和探针信息如下：BCSP31-F:5'-TGCATCCCGGCGCAGAACGCTTTTACAAGGAA-3'、BCSP31-R:5'-ATAACGAGCTGCCGCAATGTCACCCTTCAATT-3'、BCSP31-Probe:5'-GCGGGCGTGCTGAAATAATCCCTCAATGA-FAM-dT-THF-GG-BHQ1-dTTCCTGATATCTTA-dSpacer-3'其中，FAM-dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，BHQ1-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，3'用dSpacer阻断链的延伸。本专利技术提供一种利用上述荧光定量RPA引物组和荧光探针检测布氏菌的方法，包括如下步骤：1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA；2)RPA步骤：将本专利技术设计荧光定量RPA引物组和荧光探针及各反应组分，分别加入反应体系中，40℃反应20min，每30s收集一次FAM荧光信号。3)结果检测：依据荧光定量扩增曲线判定检测结果。本专利技术的荧光定量RPA引物组可用于制备检测试剂盒。本专利技术引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：20min即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为10个拷贝；2)特异性强：采用PRA引物组和荧光探针特异性对布氏菌进行检测，与常见非布氏菌株无交叉反应；3)操作简便：配置好的RPA反应体系，设置好反应程序，置于荧光定量PCR仪或RPA反应仪中。4)高通量：可一次性进行大量样品检测，结果判定与统计由程序自动完成。附图说明图1：阳性结果荧光扩增曲线图，其中：曲线1.阳性对照，质粒DNA的荧光扩增曲线；曲线2.阴性对照，水的荧光扩增曲线。图2：荧光定量RPA方法检测阳性质粒DNA的灵敏度检测荧光扩增曲线图，其中：曲线1～7.质粒DNA的浓度分别为107拷贝/μL、106拷贝/μL，105拷贝/μL、104拷贝/μL、103拷贝/μL、102拷贝/μL、101拷贝/μL；曲线8.阴性对照。图3:荧光定量RPA方法特异性检测荧光扩增曲线图，其中：曲线1.Brucellasuisbiovar1S1330；曲线2.B.suisbiovar2Thomsen；曲线3.B.suisbiovar3686；曲线4.B.suisbiovar440；曲线5.B.abortusbiovar1A544；曲线6.B.abortusbiovar286/8/59；曲线7.B.abortusbiovar3Tulya；曲线8.B.abortusbiovar4292；曲线9.B.abortusbiovar5B3196；曲线10.B.abortusbiovar6870；曲线11.B.abortusbiovar763/75；曲线12.B.abortusbiovar9C68；曲线13.B.melitensisbiovar116M；曲线14.B.melitensisbiovar263/9；曲线15.B.melitensisbiovar3Ether；曲线16.B.ovis63/290；曲线17.B.canisRM6/66；曲线18.B.neotomae5K33；曲线19.S2；曲线20.104M；曲线21.M5-90；曲线22.EscherichiacoliK99；曲线23.PasteurellamultocidaC48-1；曲线24.StreptococcussuisST171；曲线25.PseudomonasaeruginosaDI-1；曲线26.阳性对照；曲线；27.阴性对照。具体实施方式下面结合实例对本专利技术的方法进行详细的描述。一、用于检测布氏菌的RPA引物和荧光探针的设计BCSP31基因是布氏菌高度保守的基因，也是分子生物学方法检测布氏菌常选的靶基因，存在于所有的布氏菌中。本专利技术使用Oligo软件首先根据BCSP31基因设计了适用于布氏菌通用检测的多组引物和荧光探针。设计筛选合适的引物是进行荧光定量RPA反应的关键，首先按exo-RPA方法要求设计了长度为46nt的探针。随后在探针的上游和下游位置设计引物，引物设计的要求包括：引物5′端最好为C，并避免出现连续的G，3′端最好为C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测布氏菌的荧光定量RPA引物组和荧光探针，其特征在于，所述的引物和探针的信息如下：BCSP 31‑F:5'‑TGCATCCCGGCGCAGAACGCTTTTACAAGGAA‑3'、BCSP 31‑R:5'‑ATAACGAGCTGCCGCAATGTCACCCTTCAATT‑3'、BCSP 31‑Probe:5'‑GCGGGCGTGCTGAAATAATCCCTCAAT GA‑FAM‑dT‑THF‑GG‑BHQ1‑dTTCCTGATATCTTA‑dSpacer‑3'；其中，FAM‑dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，BHQ1‑dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，3'用dSpacer阻断链的延伸。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测布氏菌的荧光定量RPA引物组和荧光探针，其特征在于，所述的引物和探针的信息如下：BCSP31-F:5'-TGCATCCCGGCGCAGAACGCTTTTACAAGGAA-3'、BCSP31-R:5'-ATAACGAGCTGCCGCAATGTCACCCTTCAATT-3'、BCSP31-Probe:5'-GCGGGCGTGCTGAAATAATCCCTCAATGA-FAM-dT-THF-GG-BHQ1-dTTCCTGATATCTTA-dSpacer-3'；其中，FAM-dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，BHQ1-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，3'用...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈义平，秦立得，南文龙，陈羽琪，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东,37