The invention belongs to the field of biotechnology, and specifically relates to a primer, kit and detection method for mycoplasma cell detection; the kit in the invention includes two pairs of primer combinations needed for PCR amplification, which can specifically amplify about 250bp sequence between 16S gene and 23S gene of various mycoplasmas, and at the same time two pairs of primers. Primer amplification ensures the accuracy of the detection results, and the kit also includes the pre-reaction mixture needed for PCR amplification, including Taq enzyme, dNTP and buffer, etc. The kit in the invention can quickly and efficiently distinguish whether there is mycoplasma contamination in cells, and the detection results are accurate, and can be batched at the same time. Testing.
【技术实现步骤摘要】
一种细胞支原体检测引物、试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物
,具体涉及一种细胞支原体检测引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(0.1-0.6μm)没有细胞壁的原核细胞型微生物。由于支原体大小非常小,大约有1%的支原体能通实验室常规0.2μm孔径的过滤菌膜,同时支原体能在人工培养基培养中易繁殖,支原体污染已经成为细胞培养中一种主要的污染源。多数支原体对一般的抗生素均不敏感因而很难杀死支原体,而轻度污染后的细胞无论是肉眼观察还是在普通显微镜下观察细胞状态均无变化。因此极易忽视支原体污染问题。已有的报道显示世界各国细胞系支原体污染的比例高达30-60%。支原体污染细胞后能改变细胞所有的功能:如细胞内DNA、RNA和蛋白质表达水平,使得实验结果的真实性和可靠性都发生了改变。目前许多杂志投稿都要求培养的细胞都要进行支原体检测。目前检测细胞支原体污染的主要方法有:①DNA荧光染色法;②分离培养法;③核酸杂交法;④扫描电镜检测法。但这几种检测方法都存在检测精密度不准确、检测过程复杂、耗时同时费用昂贵等缺点。随着分子生物学技术的发展,目前已发展的最方便快捷的检测方法为PCR检测。该方法主要根据支原体的rRNA基因序列在不同支原体之间高度保守,而16S基因和23S基因之间在不同亚种之间有着序列和长度的不同。通过在此区间设计套式PCR引物扩增,利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。该方法具有灵敏度高、检测时间短以及检测费用便宜等优点。目前已经公开的一些PCR检测方法主要通过支原体rRNA序列保守合成引物进行PCR扩增,但这些方法对实验环境要求高 ...
【技术保护点】
1.一种检测细胞支原体的引物,其特征在于,所述引物包括外部引物和内部引物,其中,所述外部引物的正向引物序列为:ACACCATGGGAGCTGGTAAT(MICO S1);所述外部引物的反向引物序列为:CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT (MICO A1);其中M和Y为兼并引物,W和Y为A、T、G或C中任何一种碱基;其中,所述内部引物的正向引物序列为:GTTCTTTGAAACTGAAT (MICO S2),所述内部引物的反向引物序列为:GCATCCACCAWAWACTCT (MICO A2);其中W为兼并引物,W为A、T、G或C中任何一种碱基。
【技术特征摘要】
1.一种检测细胞支原体的引物,其特征在于,所述引物包括外部引物和内部引物,其中,所述外部引物的正向引物序列为:ACACCATGGGAGCTGGTAAT(MICOS1);所述外部引物的反向引物序列为:CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT(MICOA1);其中M和Y为兼并引物,W和Y为A、T、G或C中任何一种碱基;其中,所述内部引物的正向引物序列为:GTTCTTTGAAACTGAAT(MICOS2),所述内部引物的反向引物序列为:GCATCCACCAWAWACTCT(MICOA2);其中W为兼并引物,W为A、T、G或C中任何一种碱基。2.一种检测细胞支原体的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的检测细胞支原体的引物,其中,所述引物浓度为200pmol/µL。3.根据权利要求2所述的一种检测细胞支原体的试剂盒,其特征在于,所述引物具体配制过程为:将1µL的MICOS1、1µLMICOA1和48µL的TE混合,命名为引物一,用于PCR第一轮扩增;将1µL的MICOS2、1µLMICOA2和48µL的TE混合,命名为引物二,用于PCR第二轮扩增,引物分装编号后可置于-20℃长期保存。4.根据权利要求2所述的一种检测细胞支原体的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR扩增所需的预反应液,该预反应液包括PCR扩增所需的全部材料,包括Taq酶、dNTP和缓冲液,按一定比例混合分装。5.根据权利要求2所述的一种检测细胞支原体的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照,所述阳性对照为含有支原体16s和23s间隔保守序列的DNA纯化片段;所述阴性对照为无任何污染的无菌水。6.根据权利要求2所述的一种检测细...
【专利技术属性】
技术研发人员:王强,任美佳,师忠港,鞠小丽,夏恒传,刘晓勇,
申请(专利权)人:江苏大学,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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