当前位置: 首页 > 专利查询>江苏大学专利>正文

一种细胞支原体检测引物、试剂盒及检测方法技术

技术编号:19357835 阅读:27 留言:0更新日期:2018-11-07 20:26
本发明专利技术属于生物技术领域,具体涉及一种细胞支原体检测引物、试剂盒及检测方法;本发明专利技术中所述试剂盒包括PCR扩增所需要的两对引物组合,该引物组合可以特异性扩增各种支原体中的16S基因和23S基因之间约250bp序列,同时两对引物扩增保证了检测结果的准确性,试剂盒中还包括PCR扩增所需要的预先反应混合物,混合物中包括Taq酶、dNTP和缓冲液等;本发明专利技术中的试剂盒可以快速高效的区别细胞中是否存在支原体污染,检测结果准确,同时可以批量进行检测。

A primer, kit and detection method for detection of Mycoplasma cells

The invention belongs to the field of biotechnology, and specifically relates to a primer, kit and detection method for mycoplasma cell detection; the kit in the invention includes two pairs of primer combinations needed for PCR amplification, which can specifically amplify about 250bp sequence between 16S gene and 23S gene of various mycoplasmas, and at the same time two pairs of primers. Primer amplification ensures the accuracy of the detection results, and the kit also includes the pre-reaction mixture needed for PCR amplification, including Taq enzyme, dNTP and buffer, etc. The kit in the invention can quickly and efficiently distinguish whether there is mycoplasma contamination in cells, and the detection results are accurate, and can be batched at the same time. Testing.

【技术实现步骤摘要】
一种细胞支原体检测引物、试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物
,具体涉及一种细胞支原体检测引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(0.1-0.6μm)没有细胞壁的原核细胞型微生物。由于支原体大小非常小,大约有1%的支原体能通实验室常规0.2μm孔径的过滤菌膜,同时支原体能在人工培养基培养中易繁殖,支原体污染已经成为细胞培养中一种主要的污染源。多数支原体对一般的抗生素均不敏感因而很难杀死支原体,而轻度污染后的细胞无论是肉眼观察还是在普通显微镜下观察细胞状态均无变化。因此极易忽视支原体污染问题。已有的报道显示世界各国细胞系支原体污染的比例高达30-60%。支原体污染细胞后能改变细胞所有的功能:如细胞内DNA、RNA和蛋白质表达水平,使得实验结果的真实性和可靠性都发生了改变。目前许多杂志投稿都要求培养的细胞都要进行支原体检测。目前检测细胞支原体污染的主要方法有:①DNA荧光染色法;②分离培养法;③核酸杂交法;④扫描电镜检测法。但这几种检测方法都存在检测精密度不准确、检测过程复杂、耗时同时费用昂贵等缺点。随着分子生物学技术的发展,目前已发展的最方便快捷的检测方法为PCR检测。该方法主要根据支原体的rRNA基因序列在不同支原体之间高度保守,而16S基因和23S基因之间在不同亚种之间有着序列和长度的不同。通过在此区间设计套式PCR引物扩增,利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。该方法具有灵敏度高、检测时间短以及检测费用便宜等优点。目前已经公开的一些PCR检测方法主要通过支原体rRNA序列保守合成引物进行PCR扩增,但这些方法对实验环境要求高,并且实验成本较昂贵,最主要还容易出现假阳性等现象,检测的支原体品种有限。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速检测细胞支原体的引物、试剂盒和检测方法,具体来说本专利技术涉及PCR扩增支原体所包含的全部组成成分和详细步骤。本专利技术提供了快速检测细胞支原体的引物,该引物是根据不同支原体rRNA基因序列保守设计(NCBI数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/),包括外部引物和内部引物。其中,外部引物的正向引物序列为:ACACCATGGGAGCTGGTAAT(MICOS1,SEQ.ID.NO.1);外部引物的反向引物序列为:CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT(MICOA1,SEQ.ID.NO.2);其中W和Y为兼并引物,W和Y为A、T、G或C中任何一种碱基。其中,内部引物的正向引物序列为:GTTCTTTGAAACTGAAT(MICOS2,SEQ.ID.NO.3),内部引物的反向引物序列为:GCATCCACCAWAWACTCT(MICOA2,SEQ.ID.NO.4);其中W为兼并引物,W为A、T、G或C中任何一种碱基。本专利技术还提供一种快速检测细胞支原体的试剂盒,所述试剂盒包括上述快速检测细胞支原体的引物,其中,各个引物浓度为200pmol/µL。具体配制过程为:将1µL的MICOS1和1µLMICOA1和48µL的TE混合后,命名为引物一,用于PCR第一轮扩增;将1µL的MICOS2和1µLMICOA2和48µL的TE混合后,命名为引物二,用于PCR第二轮扩增,引物分装编号后可置于-20℃长期保存。引物一用于特异扩增16S基因和23S基因之间序列,扩增产物约100-250bp;引物二用于对扩增产物进行富集优化扩增检测是否有支原体污染。本专利技术所述的试剂盒还包括PCR扩增所需的预反应液,该预反应液包括PCR扩增所需的全部材料,如Taq酶(快速Taq酶)、dNTP和缓冲液等,按一定比例混合分装。所述预反应液为预先混合配置后分装,为了使用方便将装配放入试剂盒。本专利技术中所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照模板,阳性对照为含有支原体16s和23s间隔保守序列的DNA纯化片段;阴性对照为无任何污染的无菌水。本专利技术中所述试剂盒还包含裂解细胞所需要的裂解液,培养的细胞离心后收集去除上清加入本裂解液即可获得样品用于PCR扩增。本专利技术还提供一种细胞支原体检测方法,所述方法基于所述检测试剂盒完成,具体检测方法包括如下步骤:(1)细胞DNA的收集:培养的细胞,当细胞密度达到70-90%密度时候,吸取培养的细胞上清,将培养的细胞用5-10mL预冷的PBS洗涤2-3次。洗涤完毕后将细胞吹打悬浮在1mL中的PBS中,12000rpm/分钟离心1min后弃上清;将离心后的细胞上清用100µL的细胞裂解液悬浮在1.5mL离心管中,随后将洗涤完毕后的悬浮液在98℃加热10分钟,并在12000rpm/分钟离心1分钟后收集上清。(2)PCR检测支原体:首先配制引物:将1µL的MICOS1、1µL的MICOA1和48µL的TE混合后,命名为引物一,用于PCR第一轮扩增;将1µL的MICOS2、1µLMICOA2和48µL的TE混合后,命名为引物二,用于PCR第二轮扩增,引物分装编号后可置于-20℃长期保存。准备PCR预反应液:PCR预反应液预先配制好后可长期-20℃保存,每个PCR预反应液配置过程为:10×PCRbuffer2µL,5×dNTP混合物1µL,Taq酶0.1µL,无菌水14.9µL,合计18µL。根据每次反应所需要的数量准备上述PCR预反应液,也可提前准备100次量在-20℃保存,每次使用前溶解即可。准备第一次PCR扩增反应液:取上述准备好的PCR预反应液18µL加入1µL上述引物一(引物终浓度为4pmol/µL),再加入1µL上述步骤(1)中准备的细胞裂解液,充分混合上述混合物后2000rpm/min离心1分钟。第一次PCR反应:将上述混合物放入PCR反应仪,设置PCR反应条件;反应结束后取出样品置于4℃保存。准备第二次PCR扩增反应液:取上述准备的PCR预反应液18µL加入1µL上述引物二(引物终浓度为4pmol/µL)。最后加入1µL上述第一次PCR反应后的反应液,充分混合上述混合物后2000rpm/min离心1分钟。第二次PCR反应:将上述第二次PCR扩增反应液放入PCR反应仪,设置PCR反应条件;反应结束后取出样品置于4℃保存;配制2%的琼脂糖凝胶对产物进行检测。其中两次PCR扩增条件均为94℃反应10秒;随后94℃反应30秒,55℃反应30秒,72℃反应30秒,反应循环为30个循环。与现有技术相比较,本专利技术的优势在于:本专利技术与与现有公开检测支原体检测方法相比,极大的优化了检测步骤,试剂盒中预先混装好了PCR反应所需的全部成分,方便了操作者操作。本专利技术中采用了两对引物进行扩增可以保证扩增结果的准确性,防止非特异性的扩增,保证检测结果的准确性;同时在设计外部引物的时候采用了兼并引物的设计方法,该兼并引物可以扩增细胞中污染的大部分支原体。PCR扩增程序简单,两步PCR扩增程序一致,方便了扩增过程,可以保证在所有的实验室中高效扩增检测。进行PCR扩增采用两轮PCR扩增,每次反应时间50分钟,两次耗时不到两小时。本试剂盒通过采用兼并引物的设计,可以检测大部分的支原体污染。同时采用试剂盒的形式设计,极大的简化了步骤和扩增过程,防止不必要的污染和错误。附图说明图1为本专利技术试剂盒检测不同细胞系的琼脂糖凝胶电泳,其中1-6分别为2本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.一种检测细胞支原体的引物,其特征在于,所述引物包括外部引物和内部引物,其中,所述外部引物的正向引物序列为:ACACCATGGGAGCTGGTAAT(MICO S1);所述外部引物的反向引物序列为:CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT (MICO A1);其中M和Y为兼并引物,W和Y为A、T、G或C中任何一种碱基;其中,所述内部引物的正向引物序列为:GTTCTTTGAAACTGAAT (MICO S2),所述内部引物的反向引物序列为:GCATCCACCAWAWACTCT (MICO A2);其中W为兼并引物,W为A、T、G或C中任何一种碱基。

【技术特征摘要】
1.一种检测细胞支原体的引物,其特征在于,所述引物包括外部引物和内部引物,其中,所述外部引物的正向引物序列为:ACACCATGGGAGCTGGTAAT(MICOS1);所述外部引物的反向引物序列为:CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT(MICOA1);其中M和Y为兼并引物,W和Y为A、T、G或C中任何一种碱基;其中,所述内部引物的正向引物序列为:GTTCTTTGAAACTGAAT(MICOS2),所述内部引物的反向引物序列为:GCATCCACCAWAWACTCT(MICOA2);其中W为兼并引物,W为A、T、G或C中任何一种碱基。2.一种检测细胞支原体的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的检测细胞支原体的引物,其中,所述引物浓度为200pmol/µL。3.根据权利要求2所述的一种检测细胞支原体的试剂盒,其特征在于,所述引物具体配制过程为:将1µL的MICOS1、1µLMICOA1和48µL的TE混合,命名为引物一,用于PCR第一轮扩增;将1µL的MICOS2、1µLMICOA2和48µL的TE混合,命名为引物二,用于PCR第二轮扩增,引物分装编号后可置于-20℃长期保存。4.根据权利要求2所述的一种检测细胞支原体的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR扩增所需的预反应液,该预反应液包括PCR扩增所需的全部材料,包括Taq酶、dNTP和缓冲液,按一定比例混合分装。5.根据权利要求2所述的一种检测细胞支原体的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照,所述阳性对照为含有支原体16s和23s间隔保守序列的DNA纯化片段;所述阴性对照为无任何污染的无菌水。6.根据权利要求2所述的一种检测细...

【专利技术属性】
技术研发人员:王强任美佳师忠港鞠小丽夏恒传刘晓勇
申请(专利权)人:江苏大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1