一种小分子血红素肽及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种小分子血红素肽及其制备方法，属于补铁活性物质制备技术领域。本发明专利技术提供的小分子血红素肽由包括以下步骤的方法制备得到：将血红蛋白与蛋白复合酶混合进行酶解反应；所述酶解反应的条件为在pH值为7～9的条件下，40～60℃酶解1～5h；所述蛋白复合酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶。本发明专利技术提供的小分子血红素肽中血红素的提取率高、纯度高，且所述血红素肽补铁活性高。

A small molecule heme peptide and preparation method thereof

The invention relates to a small molecule heme peptide and a preparation method thereof, belonging to the technical field of preparing iron-supplementing active substances. The small molecule heme peptide provided by the invention is prepared by a method comprising the following steps: mixing hemoglobin and protein complex enzymes for enzymatic hydrolysis; the enzymatic hydrolysis conditions are enzymatic hydrolysis at 40-60 ~C for 1-5 hours at pH 7-9; and the protein complex enzymes include alkaline protease and neutral protease. The small molecule heme peptide provided by the invention has high extraction rate, high purity and high iron supplementation activity.

【技术实现步骤摘要】
一种小分子血红素肽及其制备方法
本专利技术涉及补铁活性物质制备
，具体涉及一种小分子血红素肽及其制备方法。
技术介绍
畜禽动物血液作为屠宰场加工的副产物之一，其高值化利用一直是研究的热点。血红蛋白作为动物血液中含量最丰富的蛋白质，加强其综合运用对提高猪血附加值具有非常重要的意义。血红素是典型的卟啉类化合物，是由四个吡咯连接构成的卟啉环中心镶嵌一个铁离子形成的化合物，其相对分子质量约为616.5。对动物血液中血红素的开发利用是动物血液深加工利用的重要方向。血红素铁在食品工业上被广泛的用作补铁剂，主要有三种形式：血红素肽、氯化血红素以及血红蛋白，用于治疗和缓解缺铁性贫血。除了在食品工业上的运用，血红素铁在药物领域也是制备抗肿瘤药物-血卟啉的前体物质。目前来说，血红素肽的制备在食品工业上又叫做血液的脱色处理，制备血红素肽的方法分为三大类，第一类是化学法，如酸性丙酮法和冰醋酸法。第二类是物理法，如沉淀法和吸附法。第三类是生物法，如酶法。酸性丙酮法等化学法虽然提取率好，产物纯度高，但是残留的有机试剂会成为食品中风险成分。CMC-Na等吸附法适用于医药工业中制备成片剂，但血红素肽后期的分离纯化较难实现。相较于其他脱色方法，酶法是目前为止制备血红素肽最环保的工艺方法，产物具有更好溶解性和最小有害残留物风险。蛋白酶如胃蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶都有研究用来制备血红素肽，酶解类型又可以分为：单一酶解、复合酶解、分步酶解。同时酶解也可以与物理前处理方式相结合，如超声酶解、微波酶解、高压酶解等，这些酶解产物中都是含有适量的血红素肽。目前通过酶解制备血红素肽多存在酶解时间长、产物得率低，酶解工艺复杂等问题，因此如何简化酶解工艺，提高血红素得率，缩短酶解时间也一直是需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种小分子血红素肽及其制备方法。本专利技术提供的小分子血红素肽中血红素的提取率高、纯度高，且所述血红素肽补铁活性高。本专利技术提供了一种小分子血红素肽，由包括以下步骤的方法制备得到：将血红蛋白与复合蛋白酶混合进行酶解反应；所述酶解反应的条件为在pH值为7～9的条件下，40～60℃酶解1～5h；所述复合酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶。优选的是，所述血红素肽的分子量为3.4～14.4kDa。优选的是，所述蛋白复合酶相对于血红蛋白的用量为6000～10000U/g。优选的是，所述蛋白复合酶中碱性蛋白酶和中性蛋白酶的酶添加量比为(7～3)：(3～7)。优选的是，酶解反应完成后，采用酸沉淀法对得到的酶解反应液进行纯化。本专利技术还提供了上述技术方案所述血红素肽的制备方法，包括以下步骤：将血红蛋白与蛋白复合酶混合进行酶解反应，所述酶解反应条件为在pH值为7～9的条件下，40～60℃酶解1～5h；所述蛋白复合酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶。优选的是，所述蛋白复合酶相对于血红蛋白的用量为6000～10000U/g。优选的是，所述蛋白复合酶中碱性蛋白酶和中性蛋白酶的酶添加量比为(7～3)：(3～7)。优选的是，酶解反应完成后，采用酸沉淀法对得到的酶解反应液进行纯化。优选的是，所述酸沉淀法中采用的pH值为3～5。本专利技术提供了一种小分子血红素肽。本专利技术提供的小分子血红素肽分子量仅为3.4～14.4kDa，不仅吸收好，且本专利技术的小分子血红素肽中血红素的提取率高、纯度高，且血红素肽补铁活性高。试验结果表明，小分子血红素肽中血红素的提取率高达87.8057％，纯度为23.2693％，且本专利技术血红素肽补贴活性高于血红蛋白、氯化血红素、硫酸亚铁等铁化合物。附图说明图1为本专利技术提供的血红素标准曲线图；图2为本专利技术实施例1提供的不同酶解条件下血红素提取率和纯度结果图；图3为本专利技术实施例3提供的不同来源铁的铁吸收率比较结果图。具体实施方式本专利技术提供了一种小分子血红素肽，所述血红素肽的制备方法包括以下步骤：将血红蛋白与蛋白复合酶混合进行酶解反应，所述酶解反应条件为在pH值为7～9的条件下，40～60℃酶解1～5h；所述蛋白复合酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶。在本专利技术中，所述蛋白复合酶相对于血红蛋白的用量为6000～10000U/g，更优选为7500～9500U/g，最优选为9000U/g。在本专利技术中，所述蛋白复合酶中碱性蛋白酶和中性蛋白酶的酶添加量比为(7～3)：(3～7)，更优选为6:4。本专利技术对所述碱性蛋白酶和中性蛋白酶的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规碱性蛋白酶和中性蛋白酶的市售产品即可。在本专利技术中，所述碱性蛋白酶能够酶解珠蛋白链中的碱性氨基酸，使珠蛋白多肽链更好地伸展，暴露出血红素中心，提高血红素肽的活性。在本专利技术中，所述中性蛋白酶的作用为酶解珠蛋白肽链。本专利技术碱性蛋白酶和中性蛋白酶的组合的作用是酶解血红蛋白中的珠蛋白多肽链，尽可能充分的暴露出血红素基团。在本专利技术中，所述酶解的pH值优选为7.5～8.5，更优选为8。在本专利技术中，所述酶解的时间优选为2～4h，更优选为2h；所述酶解的温度优选为45～55℃，更优选为55℃。本专利技术对所述血红蛋白的来源没有特殊的限定，采用常规血红蛋白的常规市售产品或采用常规市售血液自行制备即可。在本专利技术中，自行制备血红蛋白时，所述血液优选包括猪血、鸡血、羊血等，更优选包括抗凝猪血。本专利技术所述血红蛋白的制备方法优选包括以下步骤：取血液，优选抗凝猪血，1700×g离心10min后血液分层，收集下层红细胞，用pH7.4的PBS缓冲液洗涤三次；破碎红细胞；破碎液在10000×g下离心30min，弃下层细胞碎片收集上清液冷冻干燥后即得血红蛋白粉末，置于-20℃低温保存。本专利技术对红细胞破碎的方法没有特殊的限定，采用常规间歇式超声粉碎仪进行破碎即可，破碎过程中优选采用碎冰降温。本专利技术所述血红蛋白优选溶于缓冲液进行酶解反应，本专利技术对所述缓冲液的种类没有特殊的限定，优选采用本领域技术人员熟知的pH缓冲液即可，如Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液。在本专利技术中，所述血红蛋白在缓冲液中的浓度优选为1g/50mL～5g/50mL，更优选为3g/50mL。酶解反应完成后，本专利技术采用酸沉淀法对得到的酶解反应液进行纯化。在本专利技术中，所述酸沉淀法中采用的pH值为3～5，更优选为4.5。具体地，本专利技术在所述纯化过程中，调节完pH值后，优选恒温振荡30min；在4000r/min下搅拌10min，然后10000rpm/min下离心30min，弃上清液收集沉淀，将沉淀洗涤三次后收集冻干，保存在-20℃冰箱。在本专利技术中，所述血红素肽的分子量为3.4～14.4kDa。本专利技术所述小分子血红素肽吸收性好，且本专利技术所述血红素肽铁吸收率高，血红素肽活性好。本专利技术得到的小分子血红素肽中的血红素提取率高，且纯度高。在本专利技术中，血红素提取率和纯度的测定方法优选包括以下步骤：本专利技术采用标准曲线-紫外可见分光光度法测定血红素含量：准确称量烘干至恒重的血红素标准品15mg，用0.1mol/L的NaOH溶液溶解配置成150μg/mL的标准母液，分别取1、2、3、4、5、6、7、8mL的标准母液定容至100mL的容量瓶中，配置成浓度分别为1.5、3、4.5、6、7.5、9、10.5、12μg/mL的标准溶液。以0.1mol/L的NaOH溶液作为空白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小分子血红素肽，其特征在于，由包括以下步骤的方法制备得到：将血红蛋白与蛋白复合酶混合进行酶解反应；所述酶解反应的条件为在pH值为7～9的条件下，40～60℃酶解1～5h；所述蛋白复合酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶。

【技术特征摘要】
1.一种小分子血红素肽，其特征在于，由包括以下步骤的方法制备得到：将血红蛋白与蛋白复合酶混合进行酶解反应；所述酶解反应的条件为在pH值为7～9的条件下，40～60℃酶解1～5h；所述蛋白复合酶包括碱性蛋白酶和中性蛋白酶。2.根据权利要求1所述的血红素肽，其特征在于，所述血红素肽的分子量为3.4～14.4kDa。3.根据权利要求1所述的血红素肽，其特征在于，所述蛋白复合酶相对于血红蛋白的用量为6000～10000U/g。4.根据权利要求1或3所述的血红素肽，其特征在于，所述复合酶中碱性蛋白酶和中性蛋白酶的酶添加量比为(7～3)：(3～7)。5.根据权利要求1所述的血红素肽，其特征在于，酶解反应完成后，采用酸沉淀法对得到的酶解反应液进...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳国锋，马素敏，何立超，金永国，马美湖，任景乐，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42