斑马鱼notch3基因突变体的制备方法技术

本发明专利技术公开了涉及一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法；包括如下步骤：确定notch3基因敲除的靶点位置；以pUC19‑gRNA scaffold质粒为模板，使用引物T7‑notch3‑sfd、tracr rev进行PCR扩增；对PCR产物纯化、体外转录获得gRNA；将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼胚胎一细胞期中，培养获得稳定遗传的notch3基因突变体。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术，通过选择独特的一段打靶区，使得斑马鱼中的notch3基因被敲除，又不“误伤”其他基因，形成Notch3敲除的斑马鱼；另外，本发明专利技术还公开了notch3基因缺失斑马鱼突变体的表型，对于研究Notch信号通路意义重大。

Preparation of zebrafish Notch3 gene mutant

The invention discloses a preparation method of zebrafish Notch3 gene mutant, including the following steps: determining the target location of Notch3 gene knockout; using pUC19 gRNA scaffold plasmid as template, using primers T7 Notch3 sfd, tracrev for PCR amplification; purifying the PCR product and obtaining gRNA by transcription in vitro; During the first cell stage of zebrafish embryos, Notch3 gene mutants with stable inheritance were obtained. The invention utilizes CRISPR/Cas9 technology to make zebrafish Notch 3 gene knocked out without \mistakenly injuring\ other genes by selecting a unique target region, and forms zebrafish with Notch 3 knockout. In addition, the invention also discloses the phenotype of zebrafish mutant with Notch 3 gene deletion, which has significance for studying Notch signaling pathway. It is important.

【技术实现步骤摘要】
斑马鱼notch3基因突变体的制备方法
本专利技术涉及一种斑马鱼突变体，具体涉及一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法。
技术介绍
CRISPR/Cas系统最早是在细菌的适应性免疫系统内发现的，其主要功能是对抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大学(OsakaUniversity)的研究人员在EscherichiacoliK12的碱性磷酸酶基因附近发现了成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR)和CRISPR相关基因(CRISPR-associatedgenes，Casgene)，目前普遍认为有40％的细菌基因组具有这样的结构。CRISPR技术是最新出现的第三代基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR/Cas9基因编辑技术源于一种微生物防御噬菌体DNA或外源质粒入侵的后天免疫系统。CRISPR/Cas系统的防御机制可以分为三个阶段。第一个阶段称为间隔序列的获得，间隔序列被识别并被整合到CRISPR基因座中两个相邻重复单元之间。第二阶段被称为CRISPR的表达，一个主要的转录本，被RNA聚合酶从CRISPR基因座转录而来。随后，特异性的核酸内切酶将pre-crRNAs切割成小的CRISPRRNAs(crRNAs)。第三个阶段称为干扰或免疫，在crRNA和Cas蛋白形成的复合物中crRNA能识别碱基对，特别是具有完全(或几乎完全)互补的外来DNA(或RNA)的区域。这样便开始了Cas蛋白对特定位点的切割。从细菌到古细菌共有三种类型的CRISPR/Cas系统，分别是TypeI、II、III，其中TypeII的运用最多。TypeII中包括标志性的Cas9蛋白，该蛋白主要促进crRNA的成熟，降解侵入的噬菌体DNA或者入侵的外源质粒。目前，CRISPR/Cas9技术已广泛用鱼小鼠、斑马鱼、果蝇、酵母、大米、小麦、细菌等各种生物上，实现了不同生物进化阶段物种的基因编辑。与锌指核酸酶(Zinc-fingernuclease，ZFN)和转录激活样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)等基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9技术有如下优势：1、Cas9不具有特异性，2、gRNA体现需要敲除的基因的特异性，靶向精确，作用高效，脱靶率低，3、廉价便捷，细胞毒性低，4、CRISPR技术更易于操作，具有更强的可扩展性。已有研究表明，人NOTCH3基因的突变引起CADASIL综合征，是一种遗传性小动脉疾病，位于19号染色体上的Notch3基因突变所致的遗传性脑小血管疾病，表现为皮质下缺血事件，并导致进行性痴呆伴假性球麻痹。因为涉及病变的位置广，故暂无法通过手术解决，且由于其为遗传性病变，药物治疗效果也欠佳，目前只能通过对症处理，但是病程进行性加重可能是难免的。目前临床无很好的治疗方法，该病已经被西医判了死刑，只能通过药物和适当保健改善生活质量。Notch3基因突变连锁的血管平滑肌细胞退化与人类“伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleukoencephalopathy，CADASIL)”的发病密切相关，90％以上的CADASIL患者可以检测到Notch3基因突变。目前尚不清楚CADASIL的发病是否由Notch3信号转导通路的改变而直接引起，或者是异常的Notch3堆积间接引起细胞毒性作用导致的，亦或者是两种因素共同作用的结果。CADASIL症状的机制尚不清楚，血管，白质和其他疾病表型的相互依赖机制和程度仍有待澄清。有报道称，用定向诱导基因组局部突变技术(Targetinginducedlocallesionsingenomes，TILLING)筛选出的由化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)诱变产生的Notch3基因定点突变斑马鱼，可以较好的作为CADASIL动物模型。该方法获得的突变体与本专利技术利用CRISPR/Cas9技术制备的突变体在最终编码的氨基酸个数及存活时间上存在差别。TILLING方法筛选出的突变体编码669个氨基酸，多数突变体在15dpf前死亡，少部分能存活到2个月，但通常也在长成成鱼前死亡。而本专利技术用CRISPR/Cas9制备的突变体只编码156个氨基酸，在11～15dpf死亡数量较多，且通常在16dpf之前全部死亡。虽然CRISPR-Cas9敲除技术广泛应用于小鼠，斑马鱼，果蝇，拟南芥等模式生物，但利用该技术对斑马鱼1号染色体全基因敲除后获得有表型的突变体比例仅占5％，可见获得有明显表型的突变体比例极低，可能原因有：1)与选取的目的基因有关；2)与基因上选取的靶点有关。因此，只有选取了合适的基因和特异敲除的靶位点同时存在的条件下，才有可能出现特征性的表型变化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：本专利技术涉及一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法，所述方法包括如下步骤：S1、确定notch3基因敲除的靶点在斑马鱼notch3的基因序列的第四个外显子上；S2、根据步骤S1确定的靶点序列设计扩增引物；S3、以pUC19-gRNAscaffold质粒为模板，使用引物T7-notch3-sfd、tracrrev进行PCR扩增；S4、对步骤S3的PCR产物进行纯化，体外转录获得gRNA；S5、将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中；S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼notch3基因突变体。优选的，步骤S2中，所述靶点序列为GGCATCTGCATGAATACACA(SEQIDNO.2)。优选的，步骤S3中，pUC19-gRNAscaffold质粒模板序列为：GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQIDNO.1)。优选的，步骤S3中，所述引物T7-notch3-sfd的序列为TAATACGACTCACTATAGGCATCTGCATGAATACACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQIDNO.3)。优选的，步骤S3中，所述引物tracrrev的序列为AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQIDNO.4)。优选的，步骤S4中，所述gRNA的序列为TAATACGACTCACTATAGGCATCTGCATGAATACACAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT(SEQIDNO.7)。优选的，步骤S5中，将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼具体为：将gRNA与Cas9蛋白混合，显微注射到斑马鱼一细胞期胚胎中；其中，gRNA终浓度为100ng/μL，Cas9蛋白终浓度为800ng/μL。优选的，步骤S6具体包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、确定notch3基因敲除的靶点在斑马鱼notch3基因序列的第四个外显子上；S2、根据步骤S1确定的靶点序列设计扩增引物；S3、以pUC 19‑gRNA scaffold质粒为模板，使用引物T7‑notch3‑sfd、tracr rev进行PCR扩增；S4、对步骤S3的PCR产物进行纯化，体外转录获得gRNA；S5、将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中；S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼notch3基因突变体。

【技术特征摘要】
1.一种斑马鱼notch3基因突变体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、确定notch3基因敲除的靶点在斑马鱼notch3基因序列的第四个外显子上；S2、根据步骤S1确定的靶点序列设计扩增引物；S3、以pUC19-gRNAscaffold质粒为模板，使用引物T7-notch3-sfd、tracrrev进行PCR扩增；S4、对步骤S3的PCR产物进行纯化，体外转录获得gRNA；S5、将gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼中；S6、培养获得稳定遗传的斑马鱼notch3基因突变体。2.根据权利要求1所述的斑马鱼notch3基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述靶点序列为如SEQIDNO.2所示的序列。3.根据权利要求1所述的斑马鱼notch3基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，pUC19-gRNAscaffold质粒模板序列为如SEQIDNO.1所示的序列。4.根据权利要求1所述的斑马鱼notch3基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述引物T7-notch3-sfd的序列为如SEQIDNO.3所示的序列。5.根据权利要求1所述的斑马鱼notch3基因突变体的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述引物tracrrev的序列为如SEQIDNO.4所示的序列。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张庆华，岳倩文，季策，徐行，张秋月，李伟明，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31