利用NK/T淋巴瘤细胞株所构建的免疫缺陷小鼠模型制造技术

本申请属于动物肿瘤模型构建技术领域，具体涉及一种利用NK/T淋巴瘤细胞株所构建的、可稳定传代的免疫缺陷小鼠模型及其构建方法的专利申请事宜。该方法包括：分别对接种对象及淋巴瘤细胞株进行预处理，制备肿瘤混悬液并注射小鼠，肿瘤细胞传代等步骤。所述免疫缺陷小鼠模型在医学中可用于药物筛选或疗效评估。本申请所提供的利用NK/T淋巴瘤细胞株构建淋巴瘤动物模型的构建方法，其利用基质胶的固定作用，可将淋巴瘤细胞固定在皮下，从而保证小鼠的成瘤率，表现出成瘤快、成瘤率高的技术优势；另一方面，传代过程中，配合相关肿瘤组织培养液的冻存操作，可随时复苏和直接构建传代用淋巴瘤动物模型。

An immunodeficient mouse model constructed from NK/T lymphoma cell line

This application belongs to the field of animal tumor model construction technology, and specifically relates to a patent application for a stable passage immunodeficient mouse model constructed by NK/T lymphoma cell line and its construction method. The method comprises the following steps: pretreatment of the inoculated object and lymphoma cell line, preparation of tumor suspension, injection of mice, and passage of tumor cells. The immunodeficient mouse model can be used for drug screening or therapeutic evaluation in medicine. This application provides a method to construct an animal model of lymphoma using NK/T lymphoma cell lines, which can immobilize lymphoma cells subcutaneously by using matrix glue fixation, thus ensuring the tumorigenic rate of mice, showing the technical advantages of fast and high tumorigenic rate; on the other hand, in the course of passage, cooperation is relevant. The cryopreservation of tumor tissue culture medium can be used to resuscitate and directly construct the animal model of lymphoma for passage at any time.

【技术实现步骤摘要】
利用NK/T淋巴瘤细胞株所构建的免疫缺陷小鼠模型
本申请属于动物肿瘤模型构建
，具体涉及一种利用NK/T淋巴瘤细胞株所构建的、可稳定传代的免疫缺陷小鼠模型及其构建方法的专利申请事宜。
技术介绍
动物肿瘤模型的构建，是相关疾病尤其是肿瘤研究中常用研究标本材料之一。其中肿瘤移植瘤模型又因其在抗肿瘤新药的筛选及疗效评估方面具有较大的应用价值，因而是主要的动物肿瘤模型构建目标之一。利用已建立的细胞株或病人肿瘤组织种植于免疫缺陷动物体内，进而构建肿瘤移植瘤模型，是目前常用的肿瘤模型构建方法。但利用这种构建方法构建实体移植瘤动物模型时较为容易，而针对淋巴瘤动物模型特别是NK/T淋巴瘤动物模型构建时，则存在较为明显的无法稳定传代的技术缺陷。因此目前尚未见到较好的利用特定淋巴瘤细胞株所构建的、可稳定传代的免疫缺陷小鼠模型构建的有关报道。现有技术中，构建淋巴瘤动物模型时，利用对应方法构建的淋巴瘤动物模型主要有：化学物质诱导型、电离辐射诱发型、癌块移植型以及人源化小鼠模型等。其中用已建立的淋巴瘤细胞株或病人淋巴瘤组织种植于免疫缺陷动物体内建立移植性淋巴瘤模型,是目前研究最多的肿瘤模型，这种模型又可分为两种：同种移植瘤模型和异种移植瘤模型。受限于构建方法差异，同种移植瘤模型研究及应用范围较为局限，其典型模型为运用鼠源性淋巴瘤细胞株A20接种同源小鼠建立的类似人弥漫性大B细胞淋巴瘤模型。而异种移植瘤模型则应用较为多见，典型的淋巴瘤细胞株如：人B细胞淋巴瘤细胞株DOHH2、FSCCLBJAB、DG75，T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat，Burkitt淋巴瘤细胞株Raji和人霍奇金淋巴瘤H/RS细胞株L1236、L428、HDLM2、L540、KMH2等，将这些常用的淋巴瘤细胞株移植小鼠后即可构建对应的淋巴瘤小鼠模型。典型工作例如：Wagner等（3′-[18F]Fluoro-3′-Deoxythymidine([18F]-FLT)asPositronEmissionTomographyTracerforImagingProliferationinaMurineB-CellLymphomaModelandintheHumanDisease，CancerResearch，2003）将DoHH2细胞株种植于CB-17SCID/SCID小鼠皮下,植入后3-4周小鼠即长出约2.0g左右的淋巴瘤。再如：邵晓枫等（人B淋巴瘤裸鼠腹腔内移植模型，中国肿瘤临床，2001）接种Raji细胞至5周龄左右雌性裸鼠腹腔并连续传代，建立B细胞淋巴瘤腹腔模型。但是需要注意的是，这些淋巴瘤移植瘤模型，或者无详细传代报道，或者并非皮下接种，而系统性的皮下移植瘤模型的构建对于淋巴瘤研究是十分重要的，因而关于这方面的工作仍有必要加强。
技术实现思路
本申请主要目的在于提供一种利用NK/T（naturalkillercell）淋巴瘤细胞株构建可稳定传代的免疫缺陷小鼠模型的构建方法，从而为相关药物筛选、疗效评估等研究奠定基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一种利用NK/T淋巴瘤细胞株构建的免疫缺陷小鼠模型的构建方法，具体包括如下步骤：（1）分别对接种对象及淋巴瘤细胞株进行预处理，接种对象采用免疫缺陷型小鼠（如NOD/SCID小鼠）；以NOD/SCID小鼠（3-4周龄、15-20g）为例，具体预处理方式为，在接种淋巴瘤细胞前，注射免疫抑制药物，例如环磷酰胺或环孢素；以注射环磷酰胺为例，具体注射方式为：小鼠腹腔内连续注射环磷酰胺两天，注射量按100mg/kg计（注射液体积按0.2mL计），每天一次；淋巴瘤细胞株采用NK/T淋巴瘤细胞株；接种当天，按如下方式处理待接种细胞：将生长状态良好的细胞培养液离心、收集细胞，并用无血清的1640培养液清洗不少于两遍，清洗后1000rpm离心5min收集细胞，再用无血清的1640培养液重悬细胞，调整细胞浓度为：（1~3）×107/200μL，优选为2×107/200μL；（2）制备肿瘤混悬液，并注射小鼠；将步骤（1）中预处理后NK/T淋巴瘤细胞株培养液与基质胶混合均匀，以此作为注射液（肿瘤混悬液），制备完成后，皮下注射至小鼠腋窝；每只小鼠注射300~500μL（优选注射液体积为400μL）；以体积比计，所述淋巴瘤细胞株培养液与基质胶的比例为1:0.8~1.5；优选比例为1:1，即，以注射液体积为400μL计，每只小鼠注射200μL的淋巴瘤细胞株培养液与200μL基质胶的混合物；需要解释的是，实验中发现，随着基质胶用量的适当增加，肿瘤的最终成瘤率及瘤体生长状况虽无明显影响，但由于基质胶影响细胞转移，导致动物体吸收瘤体细胞时间较长，进而影响最终肿瘤大小测定，而当基质胶用量较少时，肿瘤成瘤率虽然也无影响，但肿瘤生长速度明显变慢，因此，对于基质胶用量需要慎重确定最适用量范围。注射完肿瘤悬液混合液后，小鼠腹腔内注射rhIL-2（白介素-2），注射量以1.2-3万IU/kg计（优选注射量为2万IU/kg），每周注射一次（大约注射4次左右至肿瘤肉眼可见）；注射完成后，正常饲养小鼠；（3）肿瘤细胞传代，待步骤（2）中小鼠体内肿瘤直径长至1.0~1.5cm左右至成熟瘤体后，无菌环境操作剥离瘤块，并剪成小块，在研磨器里研磨分散肿瘤细胞；与步骤（2）相同，调整细胞浓度后与基质胶混合，注射小鼠；同样小鼠腹腔内注射rhIL-2；需要说明的是，采用将肿瘤组织研磨成悬液方式进行传代，或者将研磨分散后肿瘤细胞培养扩增后再进行传代均可，也可直接将肿瘤组织剪成小块进行接种（但已有实验及经验表明，这种方法成瘤率较低，并不适合实际应用）；注射完成后，正常饲养小鼠，直至肿瘤长出，表明传代成功，此为第一代小鼠（一般记录为F1代），重复此传代步骤，在传至不少于5代时，表明可稳定传代的淋巴瘤模型构建成功。对于所构建的淋巴瘤模型，可结合形态学、流式细胞学、免疫组化以及遗传学实验，对生长出来的肿瘤以及传代过程中细胞株进行鉴定，以确保传代细胞株及肿瘤模型的正确和稳定。利用NK/T淋巴瘤细胞株构建的免疫缺陷小鼠模型的构建方法所构建的免疫缺陷小鼠模型，可用于药物筛选、或疗效评估等应用。现有技术中，较少按照常规操作方式将NK/T淋巴瘤细胞株接种免疫缺陷小鼠的报道，其主要原因是：受小鼠体内外环境和其自身的免疫状况的影响，NK/T淋巴瘤细胞接种至小鼠体内后难以成瘤，且成瘤率低，而即使能长出肿瘤，也不能达到稳定传代，难以进行NK/T细胞淋巴瘤体内实验的研究。因而，这一领域一直缺少较好的、突破性的报道。本申请所提供的利用NK/T淋巴瘤细胞株构建淋巴瘤动物模型的构建方法，其利用基质胶的固定作用，可将淋巴瘤细胞固定在皮下，从而保证裸鼠的成瘤率，表现出成瘤快、成瘤率高的技术优势；另一方面，传代过程中，配合相关肿瘤组织培养液的冻存操作，可随时复苏和直接构建传代用淋巴瘤动物模型。总体而言，由于本申请所提供构建方法，可较好使动物肿瘤模型稳定传代，从而为相关研究奠定应用基础，因而具有较好的实用价值和推广应用意义。附图说明图1为本申请所提供利用NK/T淋巴瘤细胞株构建可稳定传代的免疫缺陷小鼠模型的构建方法的技术路线图；图2为对传代过程中不同代系的NKYS肿瘤组织的HE染色图；图3为对传代过程中不同代系的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用NK/T淋巴瘤细胞株构建的免疫缺陷小鼠模型的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）分别对接种对象及淋巴瘤细胞株进行预处理，接种对象采用免疫缺陷型小鼠；在接种淋巴瘤细胞前，注射免疫抑制药物；肿瘤细胞采用NK/T淋巴瘤细胞株；接种当天，调整细胞浓度为：（1~3）×107/200μL；（2）制备肿瘤悬液混合液，并注射小鼠；将步骤（1）中预处理后NK/T淋巴瘤细胞株培养液与基质胶混合均匀，以此作为肿瘤混悬液，制备完成后，皮下注射至小鼠腋窝；每只小鼠注射300~500μL注射液；以体积比计，所述淋巴瘤细胞株培养液与基质胶的比例为1:0.8~1.5；注射完肿瘤悬液混合液后，小鼠腹腔内注射rhIL‑2，注射量以1.2‑3万IU/kg计，每周注射一次至肿瘤肉眼可见；注射完成后，正常饲养小鼠；（3）肿瘤细胞传代，待步骤（2）中小鼠体内肿瘤直径长至成熟瘤体后，无菌环境操作剥离瘤块，并剪成小块，在研磨器里研磨分散肿瘤细胞；与步骤（2）相同，调整细胞浓度后与基质胶混合，注射小鼠；同样小鼠腹腔内注射rhIL‑2；注射完成后，正常培养小鼠，直至肿瘤长出，表明传代成功，此为第一代小鼠，重复此传代步骤，在传至不少于5代时，表明可稳定传代的淋巴瘤模型构建成功。...

【技术特征摘要】
1.一种利用NK/T淋巴瘤细胞株构建的免疫缺陷小鼠模型的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）分别对接种对象及淋巴瘤细胞株进行预处理，接种对象采用免疫缺陷型小鼠；在接种淋巴瘤细胞前，注射免疫抑制药物；肿瘤细胞采用NK/T淋巴瘤细胞株；接种当天，调整细胞浓度为：（1~3）×107/200μL；（2）制备肿瘤悬液混合液，并注射小鼠；将步骤（1）中预处理后NK/T淋巴瘤细胞株培养液与基质胶混合均匀，以此作为肿瘤混悬液，制备完成后，皮下注射至小鼠腋窝；每只小鼠注射300~500μL注射液；以体积比计，所述淋巴瘤细胞株培养液与基质胶的比例为1:0.8~1.5；注射完肿瘤悬液混合液后，小鼠腹腔内注射rhIL-2，注射量以1.2-3万IU/kg计，每周注射一次至肿瘤肉眼可见；注射完成后，正常饲养小鼠；（3）肿瘤细胞传代，待步骤（2）中小鼠体内肿瘤直径长至成熟瘤体后，无菌环境操作剥离瘤块，并剪成小块，在研磨器里研磨分散肿瘤细胞；与步骤（2）相同，调整细胞浓度后与基质胶混合，注射小鼠；同样小鼠腹腔内注射rhIL-2；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明智，薛伟丽，王新华，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南,41