递送融合型RNA结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种递送融合型RNA结合蛋白的表达载体，包括引导蛋白序列和RNA结合蛋白序列；引导蛋白为能够定位于外泌体和/或溶酶体的引导蛋白；RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合蛋白结构域序列。并提供一种所述载体的制备方法。还设计一种含所述的递送融合型RNA结合蛋白的表达载体的外泌体，其制备方法为：将所述载体与包装质粒一起共转染HEK293T细胞包装病毒，随后将病毒感染外泌体包装细胞，收集外泌体即得。将上述表达载体或外泌体在药物递送载体和RNA调控的相关疾病治疗中应用。本发明专利技术选取外泌体作为递送RNA结合蛋白的手段，创建了一种高效的递送改造的融合型RNA结合蛋白的方法。

Expression vector for delivering fusion RNA binding protein and preparation method and application thereof

The invention discloses an expression vector for delivering fusion RNA-binding protein, including a guiding protein sequence and a RNA-binding protein sequence; a guiding protein is a guiding protein capable of locating in exosomes and/or lysosomes; and a RNA-binding protein sequence includes a whole sequence of RNA-binding protein or a RNA-binding protein domain sequence. A preparation method of the carrier is also provided. An exosome containing the expression vector of the delivery fusion RNA binding protein is also designed. The preparation method is that the vector and the packaging plasmid are co-transfected with HEK293T cell packaging virus, and then the virus is infected with the exosome packaging cells and the exosome is collected. The above expression vectors or exocrine bodies are used in drug delivery vectors and RNA related diseases. The present invention chooses exosomes as means of delivering RNA binding proteins, and creates an efficient method of delivering modified fusion RNA binding proteins.

【技术实现步骤摘要】
递送融合型RNA结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种递送融合型RNA结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用。
技术介绍
蛋白类药物在医药领域中的比重越来越大，靶向递送蛋白类药物，特别是在组织和细胞类的蛋白药物，是整个蛋白类药物应用最为重要的环节。目前，蛋白类药物的递送手段包括：通过蛋白融合穿膜肽解决跨细胞递送的问题，利用微球或水凝胶解决蛋白质缓释的问题，通过靶向型纳米颗粒或纳米凝胶解决组织和细胞靶向性问题。然而，这些手段机制复杂，不易调控。近年来，外泌体作为细胞间蛋白和核酸信息分子传递的手段，得到越来越多的重视。外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。然而，但如何利用外泌体干预内源蛋白，目前缺乏理想策略。RNA结合蛋白通过转录后调控方式调节基因表达，其中有相当比例通过增加mRNA稳定性和翻译效率，促进基因表达，在多种疾病中扮演重要角色。这类RNA结合蛋白是理想的药物靶点，但递送手段和干预手段非常有限，如何靶向干预其功能成为瓶颈问题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种递送融合型RNA结合蛋白的表达载体及其制备方法和应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：设计一种递送融合型RNA结合蛋白的表达载体，所述表达载体包括融合蛋白序列和RNA结合蛋白序列；所述融合蛋白为能够定位于外泌体和/或溶酶体的引导蛋白；所述RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合蛋白结构域序列。优选的，所述融合蛋白为溶酶体相关膜蛋白。优选的，所述RNA结合蛋白为人抗原R(HuR)。提供一种所述递送融合型RNA结合蛋白的表达载体的制备方法，包括以下步骤：(1)Trizol提取小鼠成纤维细胞总RNA；(2)利用PromegaM-MLV反转录酶对RNA进行反转录得小鼠成纤维细胞cDNA；(3)以反转录cDNA为模板，扩增融合蛋白和RNA结合蛋白目的条带；(4)将目的条带用限制性内切酶酶切连入表达载体，即得。设计一种含所述的递送融合型RNA结合蛋白的表达载体的外泌体，其制备方法为：将所述载体与包装质粒一起共转染HEK293T细胞包装病毒，即得能够产生该融合蛋白的病毒；将该病毒感染外泌体包装细胞，如间充质干细胞MSCs,收集感染细胞分泌的外泌体，即可获得目标外泌体。优选的，所述包装质粒为psPAX2和/或pMD2.G。将上述表达载体或外泌体在药物递送载体中应用。将上述表达载体或外泌体在RNA调控的相关疾病治疗中应用。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果在于：1.本专利技术选取定位于溶酶体和外泌体的蛋白整体或者其定位信号肽作为融合蛋白的标签蛋白，该蛋白既能实现目标融合蛋白高效装载进入外泌体，又能保障该目标融合蛋白进入受体细胞后能够有效进入溶酶体，将其所募集的内源RNA分子降解，达到干预内源基因功能的目的。2.本专利技术选取外泌体作为递送融合型RNA结合蛋白的手段，创建了一种高效的递送改造的RNA结合蛋白的方法，能够在体内发挥不同于内源天然RNA结合蛋白的功能。3.本专利技术发现该递送策略主要靶向全身多系统的巨噬细胞，能够高效递送目标蛋白至巨噬细胞的溶酶体，为有效干预巨噬细胞基因表达提供了重要手段。附图说明图1为(A)pcDNA3.1-HuR-Lamp2b的结构示意图；(B)pWPI-HuR-Lamp2b的结构示意图；(C)pcDNA3.1-Lamp2b-HuR的结构示意图；(D)pWPI-Lamp2b-HuR的结构示意图；图2为融合表达载体转染外泌体包装细胞外泌体的示意图；图3为粒径分析仪分析外泌体数量和大小分布；图4为电镜分析外泌体结构图；图3和图4中，从左至右依次为对照组、Lamp2b-HuR组和HuR-Lamp2b组；图5为WesternBlot检测外泌体及包装细胞中融合蛋白表达图；图6改构外泌体靶向巨噬细胞的荧光图；图7为改构外泌体高效进入溶酶体的荧光图；图8为改构外泌体降低天然蛋白靶基因miR-155。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。溶酶体相关膜蛋白(Lamps)是位于溶酶体膜上的一组高糖基化跨膜蛋白，Lamp2b是维持溶酶体膜完整性得蛋白之一，参与分子伴侣介导自噬、胆固醇运输和抗原提呈等重要生理过程。人抗原R(HuR)是最早发现的RNA结合蛋白之一，可增加多种生长因子、细胞因子mRNA的稳定性，从而上调蛋白质表达。实施例一：构建RNA结合蛋白Lamp2b-HuR外泌体构建具体步骤如下：(1)Trizol提取小鼠成纤维细胞总RNA；(2)利用PromegaM-MLV反转录酶对RNA进行反转录得小鼠成纤维细胞cDNA；反应体系如表1所示：表1反应体系RNA模板2μg5×RTbuffer4μldNTP混合液(10mM)2μl0.1MDTT2μlM-MLV逆转录酶1μl总体系20μl将上述试剂混匀，低速短离心，置于37℃恒温箱中作用1～2h，-20℃保存。(3)以反转录cDNA为模板，扩增目的条带；引物和PCR反应体系如表2和表3所示：表2反应引物引物名称引物序列Lamp2b5FATCCGCTAGCGGTCGCCACCATGTGCCTCTCTCCGGTTLamp2b5RGTCACTCGAGCATAAAGGCAAGTACCCTTTGAALamp2b3FGTCACTCGAGGTCACATCCGGAGGTGCAGAATGGGAGATGAATTTCALamp2b3RATCCGGATCCTTAGTGTTACAGAGTCTGATATCCHuRFGCCCTCGAGCAATGTCTAATGGTTATGAAGACHuRRCCCTCCGGATTTGTGGGACTTGTTGGTTTTGAAG表3反应体系PCR反应条件为：预变性，95℃3min；循环，95℃15s，58℃15s，72℃30s～2min(随产物长短而定)，共设30个循环。(4)克隆：首先将Lamp2b5F/R的PCR产物通过限制性内切酶Nhe1和Xho1克隆至pcDNA3.1载体得pcDNA3.1-Lamp2b5；然后将Lamp2b3F/R的PCR产物再通过限制性内切酶Xho1和BamH1克隆至前述pcDNA3.1-Lamp2b5载体得pcDNA3.1-Lamp2b；最后将HuR的PCR产物通过限制性内切酶Xho1和BspE1连入前述pcDNA3.1-Lamp2b载体得pcDNA3.1-HuR-Lamp2b，载体的结构如图1(A)所示。(5)亚克隆：利用Lamp2b5F和Lamp2b3R为引物，以pcDNA3.1-HuR-Lamp2b为模板；采用高保真的Pfumix酶，扩增融合片段；反应体系如表4所示：表4反应体系反应条件为：预变性，95℃3min；循环，95℃15s，58℃15s，72℃2min，共设30个循环。(6)将步骤(5)的PCR产物通过限制性内切酶Pme1连入pWPI载体，得pW本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种递送融合型RNA结合蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括引导蛋白序列和RNA结合蛋白序列；所述引导蛋白为能够定位于外泌体和/或溶酶体的引导蛋白；所述RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合蛋白结构域序列。

【技术特征摘要】
1.一种递送融合型RNA结合蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括引导蛋白序列和RNA结合蛋白序列；所述引导蛋白为能够定位于外泌体和/或溶酶体的引导蛋白；所述RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合蛋白结构域序列。2.根据权利要求1所述的递送融合型RNA结合蛋白的表达载体，其特征在于，所述融合蛋白中引导蛋白为溶酶体相关膜蛋白。3.根据权利要求1所述的递送融合型RNA结合蛋白的表达载体，其特征在于，所述RNA结合蛋白为人抗原R。4.一种权利要求1所述的递送融合型RNA结合蛋白的表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）Trizol提取小鼠成纤维细胞总RNA；（2）利用PromegaM-MLV反转录酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁丽君，李者龙，杨国栋，周雪莹，赵联璧，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61