增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建方法和应用。所述表达载体包括目标RNA结合蛋白序列和外泌体膜靶向蛋白序列；所述目标RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合结构域序列；所述外泌体膜靶向蛋白能够定位于外泌体。同时设计一种所述的增强目标RNA装载的融合蛋白的表达载体的构建方法；制备一种含增强目标RNA装载的融合蛋白的表达载体的外泌体。并将所述表达载体或所述外泌体在基因治疗的靶向递送、RNA调控的相关疾病治疗中应用。本发明专利技术可实现对候选RNA分子高效装载，同时减少外泌体对细胞内源RNA的加载。可作为基因治疗的靶向递送提供优化型载体。

Expression vector for enhancing target RNA loading into exocrine fusion protein and construction method and application thereof

The invention discloses an expression vector for enhancing the fusion protein loaded into exosome by target RNA, and a construction method and application thereof. The expression vector includes a target RNA binding protein sequence and a secretory membrane targeting protein sequence; the target RNA binding protein sequence includes a complete sequence of RNA binding protein or a RNA binding domain sequence; the exosome membrane targeting protein can be localized in the exosome. At the same time, a construction method of the expression vector of the fusion protein loaded by the enhanced target RNA is designed, and an exosome containing the expression vector of the fusion protein loaded by the enhanced target RNA is prepared. The expression vector or the exosome are applied in the targeted delivery of gene therapy and the treatment of related diseases regulated by RNA. The invention can efficiently load candidate RNA molecules and reduce the loading of endogenous RNA by exosomes. It can be used as an optimized carrier for targeted delivery of gene therapy.

【技术实现步骤摘要】
增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建方法和应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建方法和应用。
技术介绍
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。CD9是一种四次跨膜分子，是外泌体的标志性膜分子。目前多个研究报道，通过改造CD9分子，如通过与EGFP融合可以实现外泌体的示踪，通过将CD9胞外段与靶向肽融合，能够增强外泌体的靶向性。RNA结合蛋白通过转录后调控方式调节基因表达，其中有相当比例通过增加mRNA稳定性和翻译效率，促进基因表达，在多种疾病中扮演重要角色。研究表明，RNA结合蛋白在外泌体RNA分选中发挥着重要的作用。目前，如何利用RNA结合蛋白高效装载目的RNA至外泌体，以提升外泌体效能，尚缺乏有效手段。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建方法和应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术思路如下：专利技术人长期大量研究发现可利用RNA结合蛋白结合目的RNA，协助RNA进入外泌体，高效加载目的RNA，改构的外泌体作为细胞间蛋白和核酸信息分子传递的手段，可以有效实现干预内源蛋白的目的。改构外泌体加载目标RNA，并递送至目标细胞的流程如图1所示：在左侧的包装细胞，CD9-HuR融合蛋白和待包装的RNA(miR155或带ARE的mRNA)一并转染入包装细胞，其产生的外泌体被受体细胞吞噬后，可以释放包装的目标RNA，目标RNA可以在受体细胞发挥其抑制基因表达(装载miRNA时)或者翻译成功能蛋白(装载mRNA时)，实现干预目的基因的功能。具体采用如下技术方案：设计一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体，所述表达载体包括目标RNA结合蛋白序列和外泌体膜靶向蛋白序列；所述目标RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合结构域序列；所述外泌体膜靶向蛋白能够定位于外泌体。优选的，所述外泌体膜靶向蛋白为CD9。优选的，所述RNA结合蛋白为人抗原R。设计一种所述的增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)提取小鼠成纤维细胞总RNA；(2)对RNA进行反转录得小鼠成纤维细胞cDNA；(3)以所述反转录cDNA为模板，扩增外泌体膜靶向蛋白和RNA结合蛋白目的条带；(4)将目的条带经限制性内切酶酶切连入表达载体，即得。制备一种含增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体的外泌体：将所述载体与包装质粒一起共转染HEK293T细胞包装病毒，包装病毒与目的RNA共同转染外泌体包装细胞，细胞分泌的外泌体即为目的外泌体。优选的，所述包装质粒为psPAX2和/或pMD2.G。将所述表达载体或所述外泌体在基因治疗的靶向递送中应用。将所述表达载体或所述外泌体在RNA调控的相关疾病治疗中应用。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果在于：1.本专利技术的表达载体与待加载的RNA共同转染或感染外泌体包装细胞，表达的融合蛋白就能够携带某类RNA进入外泌体，该外泌体可以显著提升外泌体装载目标RNA的效率，同时当该外泌体进入受体细胞后，可以有效递送RNA，发挥RNA的功能。2.本专利技术可以实现对候选RNA分子(miRNA，siRNA，mRNA，lncRNA)进行高效装载，与此同时还可以减少外泌体对细胞内源RNA的加载，最大限度降低非期望的RNA进入外泌体。3.本专利技术可作为基因治疗的靶向递送提供优化型载体，意义重大。附图说明图1为改构外泌体加载目标RNA，并递送至目标细胞的流程示意图；图2为pcDNA3.1-CD9-HuR结构示意图；图3为pWPI-CD9-HuR的结构示意图；图4为CD9-HuR在包装细胞改构外泌体的示意图；图5为粒径分析仪分析外泌体数量和大小分布图；图6为电镜分析改构外泌体的形态特征图；图7为WesternBlot检测外泌体及包装细胞中融合蛋白及外泌体表面标志表达图；其中，A为细胞及外泌体融合蛋白CD9-HuR的表达；B为细胞及外泌体中外泌体标志物的表达；图8为外泌体水平装载目标RNAmiR155的加载效率图；其中，A为细胞中miR155的表达；B为外泌体中miR155的表达，细胞中部分miR155转移到外泌体；图9为细胞水平目标RNAmiR155的表达效率及对靶基因表达SOCS1的影响图；其中，a为共培养示意图；b为荧光标记的外泌体进入THP1细胞；c为不同处理THP1中miR155的表达；d为不同处理THP1细胞中SOCS1的蛋白表达水平的改变；图10为动物水平观察目标RNAmiR155的表达效率及对靶基因表达的影响；其中，a为外泌体在小鼠全身的分布；b为免疫荧光显示外泌体在肝脏定位情况；c为离体器官水平外泌体的定位情况；d～h为qPCR检测外泌体向各个器官递送miR155的情况；图11为dCas9及dCas9-AREs结构示意图；图12为C/ebpαgRNA构建的示意图；图13为CD9-HuR外泌体中dCas9-ARE的加载效率图；图14为脂肪干细胞ASC细胞中dCas9ARE/gRNA@CD9-HuR外泌体显著抑制C/ebpα的表达，而对照外泌体dCas9/gRNA@CD9-HuR无此效应；图15为动物水平dCas9ARE/gRNA@CD9-HuR外泌体显著抑制肝脏C/ebpα的表达；具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。人抗原R(HuR)是最早发现的RNA结合蛋白之一，可增加多种生长因子、细胞因子mRNA的稳定性，从而上调蛋白质表达。实施例一：构建RNA结合蛋白外泌体构建具体步骤如下：(1)Trizol提取小鼠成纤维细胞总RNA；(2)利用PromegaM-MLV反转录酶对RNA进行反转录得小鼠成纤维细胞cDNA；反应体系如表1所示：表1反应体系RNA模板2μg5×RTbuffer4μldNTP混合液(10mM)2μl0.1MDTT2μlM-MLV逆转录酶1μl总体系20μl将上述试剂混匀，低速短离心，置于37℃恒温箱中作用1h，随后80℃失活5min，-20℃保存。(3)以反转录cDNA为模板，克隆RNA结合蛋白HuR的CDS区和膜分子CD9的CDS区；引物和PCR反应体系如表2和表3所示：表2反应引物表3反应体系PCR反应条件为：预变性，95℃3min；循环，95℃15s，58℃15s，72℃30s～2min(随产物长短而定)，共设30～35个循环。(4)克隆：首先将CD9的PCR产物通过限制性内切酶Nhe1和Xho1克隆至pcDNA3.1载体得pcDNA3.1-CD9；然后将HuR的PCR产物再通过限制性内切酶Xho1和EcoR1克隆至前述pcDNA3.1-CD9载体得pcDNA3.1-CD9-HuR；得到的pcDNA3.1-CD9-HuR，载体的结构如图2所示。(5)亚克隆：利用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括目标RNA结合蛋白序列和外泌体膜靶向蛋白序列；所述目标RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合结构域序列；所述外泌体膜靶向蛋白能够定位于外泌体。

【技术特征摘要】
1.一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括目标RNA结合蛋白序列和外泌体膜靶向蛋白序列；所述目标RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合结构域序列；所述外泌体膜靶向蛋白能够定位于外泌体。2.根据权利要求1所述的增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体，其特征在于，所述外泌体膜靶向蛋白为CD9。3.根据权利要求1所述的增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体，其特征在于，所述RNA结合蛋白为人抗原R。4.一种权利要求1所述的增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取小鼠成纤维细胞总RNA；（2）对RNA进行反转录得小鼠成纤维...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁丽君，李者龙，杨国栋，周雪莹，赵联璧，韦梦影，孙汶齐，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61