本发明专利技术涉及一种烟曲霉batA基因，属于基因工程技术领域。所述烟曲霉batA基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No:2所示。本发明专利技术公开的烟曲霉batA基因可作为治疗靶基因在制备或筛选曲霉病治疗药物中得到应用。batA缺失导致烟曲霉对醋酸卡泊芬净耐药，batA高表达导致烟曲霉对于醋酸卡泊芬净敏感，临床治疗中如果将batA基因表达量或活性上调后再用醋酸卡泊芬净治疗具有更高效杀菌的效果，同时避免能使batA基因表达量下调或缺失的处理以免产生耐药的风险，这为有效治疗临床深部烟曲霉感染以及控制耐药菌株，具有重要的临床应用价值。
Aspergillus fumigatus batA gene and its application
The invention relates to Aspergillus fumigatus batA gene, belonging to the field of gene engineering technology. The nucleotide sequence of the batA gene of Aspergillus fumigatus is shown as SEQ ID No:1, and the protein sequence encoded by the batA gene is shown as SEQ ID No:2. The batA gene of Aspergillus fumigatus disclosed by the invention can be used as a therapeutic target gene in preparing or screening therapeutic drugs for aspergillosis. Loss of batA leads to resistance of Aspergillus fumigatus to caspofungin acetate. High expression of batA leads to sensitivity of Aspergillus fumigatus to caspofungin acetate. In clinical treatment, if the expression or activity of batA gene is up-regulated and then treated with caspofungin acetate, the bactericidal effect will be more effective, while avoiding the place where the expression of batA gene can be down-regulated or deleted. In order to avoid the risk of drug resistance, it has important clinical application value for the effective treatment of deep Aspergillus fumigatus infection and the control of drug-resistant strains.
【技术实现步骤摘要】
一种烟曲霉batA基因及其应用
本专利技术涉及一种烟曲霉batA基因，以及缺失batA基因的烟曲霉变种对抗真菌药醋酸卡泊芬净耐药和高表达batA基因的烟曲霉变种对醋酸卡泊芬净敏感的用途，属于基因工程
技术介绍
在医学界，随着高效广谱抗生素的广泛应用、抗肿瘤治疗的深入开展，器官移植和外科其他介入性治疗的不断应用，侵袭性真菌感染的发生呈现上升趋势。在免疫体系受抑制或免疫缺陷的病人群体中，患有侵染性曲霉病的人群目前大约有2-10％，其中，全球有约300-400万人分别患有慢性肺曲霉病和过敏性肺支气管曲霉病。由于真菌的多样性、不同真菌侵染途径的相对独立性、已有抗真菌药物的抑真菌效果并不尽如人意。尤为突出的是病原真菌可以通过药物外排泵的功能性高表达表现为多药耐药性。患有免疫缺陷的病人一旦被唑类药多药抗性的曲霉菌感染，致死率达到88％。目前治疗深度曲霉感染的临床一线药物主要是伊曲康唑(ITZ)和伏立康唑(VRC)。然而，已经发现越来越多的临床分离菌对唑类药物产生耐药性。目前，新型抗真菌药物棘白菌素类(echinocandins)中的卡泊芬净Caspofunginacetate(CAS)正在被推荐为侵袭性曲霉感染的挽救疗法。但是，随着卡泊芬净的应用，临床上已经出现少量耐药念珠菌和烟曲霉菌株。因此，烟曲霉对于唑类药物的抗药性是人类健康越来越严重的一大威胁。尤其是频繁的城市改建和人口的大量流动都加剧了世界公共卫生面临的这一问题的严重性。胞外囊泡(extracellularvesicles，EVs)是细胞遭受刺激时产生并释放的超微囊性结构，是细胞旁分泌的生物活性物质之一，包括微泡(MVs)和外泌体(exosomes)，在细胞内和细胞间信息传递中起着重要作用，包括细胞和细胞间耐药性的产生。本专利技术人针对对烟曲霉囊泡上的一个重要的新型ABC(ATP-bindingcassette)转运蛋白batA在烟曲霉对醋酸卡泊芬净敏感性和耐受性方面的调节作用进行了研究，为有效地寻找新的药物靶点以及治疗真菌疾病方面具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种烟曲霉batA基因，以及该基因缺失和高表达在烟曲霉对抗真菌药醋酸卡泊芬净的影响，并分别构建了烟曲霉醋酸卡泊芬净耐药株和敏感株。技术方案一种烟曲霉batA基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。上述基因编码的蛋白序列如SEQIDNO:2所示。上述烟曲霉batA基因作为治疗靶基因在制备或筛选曲霉病治疗药物中的应用。本专利技术的烟曲霉batA基因，可用于构建烟曲霉batA基因缺失菌株和batA基因高表达菌株，所述batA基因缺失菌株为烟曲霉醋酸卡泊芬净耐药株，batA基因高表达菌株为烟曲霉醋酸卡泊芬净敏感株，本专利技术的烟曲霉醋酸卡泊芬净敏感株属于具有ABC结构域超家族的多药转运相关基因高表达株。在所述烟曲霉batA基因缺失株中batA基因不表达，在所述烟曲霉batA基因高表达株中batA基因高表达9.2倍。与野生型烟曲霉相比，所述缺失株和高表达株菌落生长速率无明显变化。本专利技术所述曲霉病治疗药物为以batA基因为治疗靶基因，使用能够诱导batA基因高表达的药物、或者以batA基因表达的蛋白为激活对象的药物，同时避免使用导致batA基因抑制表达的药物、或者以batA基因表达的蛋白为拮抗对象的药物。以batA基因为靶点，筛选或制备使该基因表达上调的药物，用于使烟曲霉对醋酸卡泊芬净敏感，从而治疗曲霉感染。例如，用醋酸卡泊芬净对烟曲霉治疗时可以通过使用模式真菌构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶gpdA的启动子来控制来使batA基因持续过量表达，或者通过制备batA蛋白激活剂，使batA基因表达的蛋白提高活力；同时避免相反的操作。有益效果：本专利技术公开了batA基因在用醋酸卡泊芬净治疗条件致病菌烟曲霉中所发挥的作用：batA缺失导致烟曲霉对醋酸卡泊芬净耐药，batA高表达导致烟曲霉对于醋酸卡泊芬净敏感。这个发现提示临床治疗中如果将batA基因表达量或活性上调后再用醋酸卡泊芬净治疗具有更高效杀菌的效果，同时避免能使batA基因表达量下调或缺失的处理以免产生耐药的风险。这为有效治疗临床深部烟曲霉感染以及控制耐药菌株，具有重要的临床应用价值。附图说明图1为烟曲霉batA基因的敲除策略；图2为烟曲霉batA基因的高表达策略。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。实验菌株见表1，构建菌株用到的引物，见表2。表1表2试剂：酵母抽提物(YeastExtract)购自Oxiod公司，葡萄糖、尿苷尿嘧啶和琼脂粉均购自上海生工，3-(N-吗琳代)丙擴酸(MOPS)、各种无机盐均购于自国药集团试剂化学有限公司。RPMI1640原料粉购自美国GIBCO公司。E-test条购自ABBiodisk公司。测试药物：用无菌双蒸水将醋酸卡泊芬净(CS)(南京森贝伽生物)配制成2mg/mL的贮备液备用。测试培养基：丰富培养基YAG(每升含酵母粉5g,葡萄糖20g，微量元素1ml,固体培养基加入2％琼脂粉，w/v)，YUU为在此基础上加入1.1g/L尿苷(U)及1.2g/l尿嘧啶(U)。YAGK与YUUK为在YAG，YUU基础上每升加入44.7gKCl。实施例1：烟曲霉batA基因的敲除烟曲霉batA基因的敲除策略见图1。试验方法：1.用于同源重组敲除DNA片段batApre-pyr4-batApost的获得：①扩增batApre-pyr4-batApost的各组成片段以野生型基因组DNA为模板用P1+P3引物PCR扩增左侧翼序列batApre，P7+P8引物PCR扩增中间筛选标记序列pyr4，P4+P6引物PCR扩增右侧翼序列batApost。切胶回收试剂盒纯化PCR产物。②batApre，pyr4和batApost三个片段的融合PCR融合PCR用于产生转化用的线性片段，模板含3部分：batApre，pyr4和batApost；引物：P2+P5，可将3个片段融为一体。融合PCR的反应程序，包括如下步骤：1.94℃-2min；2.94℃-20s；3.70℃-1s；4.0.1℃/s的速率逐渐升到55℃；5.55℃-30s；6.0.2℃/s的速率逐渐升到68℃；7.68℃4min；8.步骤2-7重复9个循环；9.94℃-20s；10.70℃-1s；11.0.1℃/s的速率逐渐升到55℃；12.55℃-30s；13.0.2℃/s的速率逐渐升到68℃；14.68℃5min，每循环一次该步骤延长5s；15.步骤9-14重复4个循环；16.94℃-20s；17.70℃-1s；18.0.1℃/s的速率逐渐升到55℃；19.55℃-30s；20.0.2℃/s的速率逐渐升到68℃；21.68℃5min每循环一次该步骤延长20s；22.步骤16-20重复9个循环；23.10℃保存。根据目的片段的大小切胶回收。2.烟曲霉野生型A1160株的转化和敲除菌株A1160ΔbatA的获得：用0.2％Tween80收集在YUU固体培养基上生长2天的A1160菌株的孢子，用无菌水本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种烟曲霉batA基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种烟曲霉batA基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。2.权利要求1所述烟曲霉batA基因编码的蛋白质，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：仲国维，袁安杰，侯斯恺，陈明聪，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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