本发明专利技术属于植物基因工程领域，公开了水稻CYC U2；1基因在控制水稻中胚轴发育中的应用，申请人发现CYC U2;1（Os04g46660）特异在水稻中胚轴表达，其CDS序列为SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术还提供了该基因的启动子序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。将CYC U2;1的启动子和全长CDS克隆到pCAMBIA1301上，转入日本晴中，所获得的转基因系均表现为中胚轴长度比野生型要长，因此通过基因工程技术提高或减弱CYC U2;1基因的表达量能够控制植物中胚轴发育，从而改善植物株型提高种子直播后的出土能力。
Application of rice CYC U2 1 gene in controlling the development of rice hypocotyl
The invention belongs to the field of plant genetic engineering, and discloses the application of rice CYC U2; 1 gene in controlling rice mesotyl development. The applicant found that CYC U2; 1 (Os04g46660) was specifically expressed in rice hypocotyl. Its CDS sequence is shown in SEQ ID NO.2 and the encoded amino acid sequence is shown in SEQ ID NO.3. The invention also provides a promoter sequence of the gene, and its sequence is shown in SEQ ID NO.1. The promoter and full-length CDS of CYC U2;1 were cloned into pCAMBIA1301 and transferred into Nippon Qingzhong. The obtained transgenic lines showed that the length of the mesotyl was longer than that of the wild type. Therefore, increasing or weakening the expression of CYC U2;1 gene by genetic engineering technology could control the development of plant mesotyl, thus improving plant type and improving seeds. The ability to excavate after direct seeding.
【技术实现步骤摘要】
水稻CYCU2；1基因在控制水稻中胚轴发育中的应用
本专利技术属于植物基因工程领域。具体涉及水稻CYCU2；1基因在控制水稻中胚轴发育中的应用，采用反向遗传学的方法，筛选出在中胚轴特异表达的CYCU2；1，利用pCYCU2-GUS转基因系证明CYCU2；1的启动子特异在中胚轴处表达；通过转基因提高CYCU2；1的表达量和RNAi技术降低CYCU2；1的表达量均证明CYCU2；1基因为控制水稻中胚轴发育的基因。
技术介绍
胚轴是植物种子和幼苗发育过程中的一个重要表型，植物的胚轴从上到下可以分为上胚轴，中胚轴和下胚轴。上胚轴通常指从胚芽到胚芽鞘节的部分，中胚轴通常指胚芽鞘节到禾本科植物盾片之间的部分，下胚轴通常指双子叶植物子叶节或禾本科植物盾片节到胚根之间的部分。在拟南芥中，下胚轴主要代表了整个胚轴表型，而在水稻中，由于上胚轴和下胚轴几乎没有发育，所以中胚轴主要代表了整个胚轴表型。在水稻等禾本科植物中，依靠中胚轴的伸长可以将植物胚芽以上部位顶到土壤上面，从而使地表以上的幼苗组织进行正常的光合作用从而为植物的正常发育提供营养，另外水稻根部吸收外部空气也是通过中胚轴的通气孔隙来介导完成的(郑相如等，1998)，因此中胚轴对于植物的生长发育十分重要。水稻主要有两种播种方式：直播和育秧移栽。与传统的育秧移栽相比，使用直播更加简便，更加节省劳动力，更加节省时间，更加高效(林建荣等，2006)，因此近年来水稻直播在我国越来越受到重视。然而水稻直播也有其局限性，因为直播种子在土壤中深度的增加会使水稻种子顶土出苗更加困难，从而使出苗率下降，产量下降。然而水稻的顶土出苗过程主要依靠其中胚轴的伸长能力，这是因为在土壤黑暗条件下，水稻种子萌发过程中，只有中胚轴的长度发生了伸长。因此在黑暗条件下中胚轴伸长能力越好的水稻品种，其顶土出苗能力越强，出苗率也越高(Dildayetal.,1990；Turneretal.,1982；张光恒等，2005)。因此水稻中胚轴的伸长能力对于直播水稻的农业生产具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供水稻CYCU2；1基因(Os04g46660)在控制水稻中胚轴发育中的应用，该基因克隆自水稻中胚轴，包含有SEQID.NO.1所示的启动子区域、具有SEQIDNO.2核苷酸所示的CDS序列，该基因编码SEQID.NO.3所示的氨基酸序列；通过CYCU2；1基因启动子(SEQID.NO：1所示序列)驱动CYCU2；1基因在水稻植株中超量表达可促进水稻中胚轴伸长，从而改善水稻品种直播出土能力。为了实现上述目的，本专利技术采取以下技术措施：申请人通过反向遗传学的方法，从水稻中胚轴中克隆CYCU2；1，利用real-timeqRT-PCR验证了CYCU2；1在中胚轴处表达的特异性。水稻CYCU2；1基因在控制水稻中胚轴发育中的应用，包括利用本专利技术提供的基因或其编码的蛋白质，用于控制水稻中胚轴发育；或是用于水稻育种；或是改善植物株型提高种子直播后的出土能力。以上所述的应用中，所述的CYCU2；1基因的CDS序列为SEQIDNO.2所示，编码的氨基酸为SEQIDNO.3所示；以上所述的应用中，优选的，所述的CYCU2；1基因可以水稻cDNA为模板，利用引物CYCU2-1306-F和CYCU2-1306-R扩增得到：CYCU2-1306-F：CGGGATCCATGGCGTCCACTGAGTTAGCGTCGGCYCU2-1306-R：GCTCTAGACTGGGCTGCCGCCGACGCCGCTTGC。以上所述的应用中，优选的，包括将CYCU2；1的启动子和全长CDS克隆到pCAMBIA1301上，转入水稻中，所获得的转基因系均表现为中胚轴长度比野生型(日本晴)变长，因此可通过该方法促进中胚轴伸长，以提高种子直播出土能力。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.CYCU2；1是一个在水稻苗期中胚轴部位特异表达的基因，这使利用该基因只改变作物胚轴长度，而不影响其它性状成为可能。2.CYCU2；1是一个改变中胚轴长度的有效基因，它可以通过直接影响中胚轴部位细胞分裂，进而改变作物的中胚轴长度。3.目前，对油菜素甾醇及独角金内酯调控中胚轴长度的分子机制并不清楚，该基因揭示了其作为油菜素甾醇及独角金内酯信号通路下游的关键元件，调控中胚轴发育的分子机制。附图说明图1为Real-timePCR实验验证CYCU2；1在水稻中胚轴特异表达示意图。图2为pCYCU2：：GUS转基因水稻GUS染色结果示意图。图3为pCYCU2::CYCU2；1转基因水稻幼苗中胚轴表型和成熟期植株表型示意图。图4为RNAi-CYCU2；1转基因水稻幼苗中胚轴表型和成熟期植株表型示意图。图5为多个独立的pCYCU2：：CYCU2；1和RNAi-CYCU2；1转基因株系的表型和表达量分析示意图。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或生物材料，如未特别说明，均已公开。实施例1：一种控制水稻中胚轴发育的基因CYCU2；1的获得：专利技术人通过反向遗传学的方法，从水稻中胚轴克隆CYCU2；1，利用Real-timePCT验证CYCU2；1在中胚轴特异表达的部位，具体步骤包括：基因CYCU2；1的克隆：反应体系的总体积为50μl，模板为日本晴cDNA1ul(约50ng)、10×KOD酶反应缓冲液5μl、25mMMgCL22μl、5mMdNTP5μl、5uM引物5μl(采用分步PCR方式，使用引物CYCU2-1306-F和CYCU2-1306-R(每条引物均为2.5μl)、1μlKOD酶，加ddH2O(无菌去离子水)至50μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃1min、68℃2min35cycles，68℃延伸10min。所用引物如下：CYCU2-1306-F:CGGGATCCATGGCGTCCACTGAGTTAGCGTCGGCYCU2-1306-R:GCTCTAGACTGGGCTGCCGCCGACGCCGCTTGC最终获得包含有SEQIDNO.2所述核苷酸的CYCU2；1基因序列，该基因编码的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示。RealtimeqRT-PCT验证CYCU4；1在水稻叶枕中特异表达：暗处生长1周的水稻日本晴苗，分别取地上部分和中胚轴，利用TiangenRNAprePlantKit(Tiangen)提取总RNA，然后利用TakaraPrimeScriptFirst-strandcDNAsynthesiskit(TaKaRa)合成第一链cDNA，然后利用实时定量PCR检测地上部分和中胚轴中的CYCYU2；1的相对表达量。实时定量PCR引物：RT-CYCU2-F：GTCGCCTCCAAGTTCGTC；RT-CYCU2-R：GTAGCTCTGGAACACGCTG。发现基因CYCU2；1在叶枕处特异性表达(图1)。实施例2：CYCU2；1基因在控制水稻中胚轴中的应用，应用过程如下：1)植物表达载体pCYCU2；1-GUS的构建扩增CYCU2；1启动子区，利用MfeI/KpnI酶切位点将片段克隆到pCAMBIA1300GNGUS(RenZH,GaoJP,LiLG,etal.Aricequantit本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.SEQ ID NO.3所示蛋白或编码SEQ ID NO.3所示蛋白的核苷酸序列在控制水稻中胚轴发育中的应用。
【技术特征摘要】
1.SEQIDNO.3所示蛋白或编码SEQIDNO.3所示蛋白的核苷酸序列在控制水稻中胚轴发育中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，所述的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。3.SEQIDNO.3所示蛋白或编码SEQIDNO.3所示蛋白的核...
【专利技术属性】
技术研发人员：王学路，孙世勇，王涛，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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