一种合成多肽及其合成方法与应用与编码该合成多肽的基因技术

本发明专利技术公开了一种合成多肽及其合成方法与应用与编码该合成多肽的基因。多肽的氨基酸序列为：Leu‑Val‑Tyr‑Pro，如序列表SEQ ID No:1所示。本发明专利技术的多肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。本发明专利技术的多肽通过氧自由基吸收能力实验（ORAC），结果表明其具有一定抗氧化能力。将此多肽应用于乙醇诱导的肝损伤细胞模型，MTT检测法检验其对LO2细胞的保护作用，结果表明其可以抑制乙醇诱导的LO2细胞存活率降低，具有一定的护肝作用，可应用于保护酒精性肝病方向。

Synthetic polypeptide and its synthesis method and application and gene encoding this synthetic polypeptide

The invention discloses a synthetic polypeptide and its synthesis method and application and a gene encoding the synthetic polypeptide. The amino acid sequence of the polypeptide is Leu Val Tyr Pro, as shown in the sequence list SEQ ID No:1. The polypeptide of the invention is synthesized by solid phase synthesis using polypeptide synthesis apparatus. The polypeptide of the invention has a certain antioxidant capacity through the oxygen free radical absorption capacity experiment (ORAC). MTT assay was used to test the protective effect of the polypeptide on LO2 cells. The results showed that the polypeptide could inhibit the decrease of the survival rate of LO2 cells induced by ethanol, and had a certain protective effect on liver. It could be used to protect the direction of alcoholic liver disease.

【技术实现步骤摘要】
一种合成多肽及其合成方法与应用与编码该合成多肽的基因
本专利技术涉及预防和治疗酒精性肝病的
，具体涉及具体涉及一种对乙醇诱导肝细胞(LO2)损伤具有保护作用的合成多肽及其应用与编码该合成多肽的基因。
技术介绍
酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD)是由于长期大量饮酒所致的慢性肝病。初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。本病在欧美国家多见，近年中国的发病率也有上升。据一些地区流行病学调查发现，中国成人的酒精性肝病患病率为4％-6％，故严重影响着人类的身体健康。酒精性肝病发病机制比较复杂，研究发现其与乙醇及其代谢产物乙醛、氧化应激、内毒素、脂质过氧化、细胞凋亡等多种因素有关。肝脏是乙醇在人体内的最重要的代谢器官，研究表明乙醇脱氢酶(ADH)，肝微粒体乙醇氧化系统(MEOS)以及过氧化氢酶(CAT)是参与乙醇代谢的三条途径。其中MEOS中核心的酶是细胞色素P4502E1(CYP2E1)，该酶会被乙醇诱导而激活，参与大部分乙醇代谢，并产生过量的活性氧(ROS)，细胞内累积的ROS会攻击细胞膜和线粒体，造成细胞的结构和功能上的损伤，使得细胞内的氧化还原失衡，从而导致肝细胞损伤或凋亡，进一步继续发展会发生肝细胞的炎症，以及肝脏纤维化，肝细胞坏死等病理变化。遗传因素被认为与酒精性肝病的发生密切相关，但具体的遗传标记尚未确定；性别因素也影响其发病率，同样的酒摄入量女性比男性易患酒精性肝病，与女性体内乙醇脱氢酶(ADH)含量较低有关。因此开发有效的解酒、醒酒药物成为国内外医药学者探讨和研究的重要课题。目前，酒精肝的治疗方法也逐渐增多,如采用秋水仙碱、丙基硫氧嘧啶、降脂药、抗内毒素剂等疗法皆有一定效果，但是这些药物都存在一定的毒副作用。生物活性肽是构成蛋白质的结构和功能片段，是对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物。其来源非常广泛，可以来源于各种生物体内，也可以通过人工合成或者生物工程方法获得。一般肽类药物的来源有天然多肽、人工修饰多肽及人工合成多肽。人工合成多肽具有结构明确、易于修饰改良和定性的特点。而且许多的科学研究也证实了合成多肽在治疗一些疾病中有着很好的作用。其不仅具有易消化吸收、食用安全性高、毒副作用极小、加工性能良好等优点，而且还具有降血压、降血脂、改善免疫调节、激素调节等多种生理功能，是获取药物的天然资源宝库，对生物活性肽的研究得到了国内外的广泛关注，许多具有生物活性的多肽在生物制药、疫苗、保健品等领域已经广泛应用于实践中。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点和不足，提高护肝药物的多样性和安全性，本专利技术的目的在于提供了一种合成多肽及其应用与编码该合成多肽的基因。该合成多肽是一种具有抗氧化活性、且可以降低乙醇对肝细胞(LO2)的毒性，提高细胞存活率，该多肽可以作为功能因子应用到药品和保健品的开发。一种合成多肽，其氨基酸序列为:Leu-Val-Tyr-Pro，其中，Leu为亮氨酸的氨基酸相应残基，Val为缬氨酸的氨基酸相应残基，Tyr为酪氨酸的氨基酸相应残基，Pro为脯氨酸的氨基酸相应残基，如序列表SEQIDNo:1所示。编码所述一种合成多肽的基因，对应基因的序列如序列表SEQIDNo:2所示。本专利技术提供的一种合成多肽能在制备预防和治疗精性肝疾病的食品、保健品及药物中应用。本专利技术所述的氨基酸序列多肽的合成，首先通过树脂的筛选，然后采用标准Fmoc方案，选用2-氯三苯甲基氯树脂(2-chlorotritylchlorideresin)进行固相合成；同时也可通过基因工程技术合成，将编码基因接入到载体中，再将载体转录到原核表达体系大肠杆菌中或真核表达体系酵母中进行表达，然后对目标多肽进行分离纯化。进一步的，本专利技术采用了氧自由基吸收能力实验(ORAC)检测了合成多肽的抗氧化活性，该合成多肽供氢能力强，具有较高ORAC活性，同时作用于乙醇诱导的肝细胞(LO2)损伤模型，护肝效果显著。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术的多肽通过氧自由基吸收能力实验(ORAC)，结果表明其具有一定抗氧化能力。将此多肽应用于乙醇诱导的肝损伤细胞模型，MTT检测法检验其对LO2细胞的保护作用，结果表明其可以抑制乙醇诱导的LO2细胞存活率降低，具有一定的护肝作用，可应用于保护酒精性肝病，且多肽是一种无毒性、健康安全的化合物，故在预防和治疗精性肝疾病的食品、保健品及药物的应用中具有十分广泛的前景。附图说明图1为序列为Leu-Val-Tyr-Pro的多肽分子结构式图。图2为多肽的HPLC图。图3为多肽的ESI-MS图。图4为不同浓度下多肽对LO2细胞存活率影响的对比图。图5为不同浓度下多肽对乙醇诱导LO2细胞毒性影响的对比图。图6为多肽对乙醇诱导LO2细胞线粒体膜电位影响的对比图。具体实施方式本专利技术公开了一种多肽及其应用。本领域技术人员可以借鉴本
技术实现思路
，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。以下就本专利技术所提供的一种合成多肽及其合成方法和应用做进一步说明。实施例1：多肽固相合成1、树脂选型(1)采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，其选用0.0125mmol,2-氯三苯甲基氯树脂(2-chlorotritylchlorideresin)，按照氨基酸序列Leu-Val-Tyr-Pro的序列特征，加入0.3mol第一个Fmoc保护氨基酸，将DCC和5％(质量分数)DMAP加入到反应器振荡反应，用NMP冲洗树脂除去多余保护氨基酸。测定第一个氨基酸与树脂的连接效率即偶合率(如表1所示)。(2)选用0.0125mmol,4-(羟甲基)苯氧甲基聚苯乙烯树脂(Wang树脂)，方法同上，测定第一个氨基酸与树脂的连接效率即偶合率(如表1所示)。表1树脂类型偶合率(％)2-chlorotritylchlorideresin树脂96.23±0.88Wang树脂90.89±1.012、合成过程采用标准Fomc方案，选用偶合率较高的2-chlorotritylchlorideresin树脂，按照氨基酸序列Leu-Val-Tyr-Pro的序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸的用量为0.1mol,加入0.3molFmoc保护氨基酸，每步缩合都加入HOBT活化保护氨基酸的羧基，每步缩合采用20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，处理20min，去除Fmoc保护基。肽侧链合成后，将含有树脂的肽链加入到如下反应液中：二氯甲烷(99％)三氟乙酸(1％)(体积分数)，将肽链从树脂上切割下来。再次将多肽加入到反应液：三氟乙酸(94.5％)、酒石酸乙二胺(2.5％)、蒸馏水(2％)、TIS(1％)(体积分数)中反应2h,脱去侧链保护基。所合成的多肽经高效液相色谱仪纯化，纯度达到99％以上，并经ESI-MS鉴定结构(如图2和图3所示)，表2为图2中的出峰顺序对应的相关参数。表2出峰顺序保留时间(min)峰面积面积占比(％)18.438691270.55056129.20764090.05104439.3361245674899.2115649.657234590.186839实施例2：合成多肽的ORAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成多肽，其特征在于：氨基酸序列为: Leu‑Val‑Tyr‑Pro，如序列表 SEQ ID No:1所示，其中，Leu为亮氨酸的氨基酸相应残基，Val为缬氨酸的氨基酸相应残基，Tyr为酪氨酸的氨基酸相应残基，Pro为脯氨酸的氨基酸相应残基。

【技术特征摘要】
1.一种合成多肽，其特征在于：氨基酸序列为:Leu-Val-Tyr-Pro，如序列表SEQIDNo:1所示，其中，Leu为亮氨酸的氨基酸相应残基，Val为缬氨酸的氨基酸相应残基，Tyr为酪氨酸的氨基酸相应残基，Pro为脯氨酸的氨基酸相应残基。2.根据权利要求1所述的一种合成多肽，其特征在于：该合成多肽具有供氢能力，ORAC活性，同时作用于乙醇诱导的肝细胞（LO2）损伤模型，具有护肝效果。3.制备权利要求1所述合成多肽的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：任娇艳，龚聪聪，尚帅明，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44