一种荧光标记的核苷酸及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种荧光标记的核苷酸，具有式I所示的结构：

Fluorescent labeled nucleotides and preparation method and use thereof

The invention discloses a fluorescent labeled nucleotides, which has the structure shown in formula I:

【技术实现步骤摘要】
一种荧光标记的核苷酸及其制备方法和用途
本专利技术属于医学生物检测
，具体涉及一种荧光标记的核苷酸及其制备方法和用途。
技术介绍
荧光标记技术是指将能发射荧光的物质通过共价结合或物理吸附等方式标记于所研究分子的某个基团上，用它的荧光特性来反映研究对象的信息。利用荧光标记试剂与被研究对象(核酸、蛋白、多肽等)吸附或共价结合后其荧光特性发生改变，从而反映出有关研究对象性能的信息。随着现代医学、生物学技术的不断发展，新型荧光标记染料的发现以及各种先进荧光检测技术和仪器，如流式细胞仪(FCM)、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)等的应用，作为一种非放射性的标记技术，荧光标记具有操作简便、稳定性高、灵敏度高和选择性好等特点，可广泛应用于细胞内外物质检测、组织及活体动物标记成像、药物分析、病理模型研究及疾病早期诊断等，在生物医学研究领域里发挥着重要的作用。核酸是生命的遗传物质，在生命活动中起重要作用。核酸的检测在疾病诊断、环境微生物鉴定、适配体等领域有重要应用。利用荧光标记物的核酸的非放射性检测是分子生物学中的重要的技术，广泛应用于DNA测序、原位杂交、液相芯片等生物检测
应用多重荧光标记对一个或多个目标核酸分子进行检测具有重要的应用意义，例如，液相芯片在荧光微球的表面偶联核酸探针分子，荧光微球是在微米级聚合物微球中装入不同发光波长和强度水平组合的荧光材料形成的具有不同荧光信号编码的球体；另一方面，通过对待测的靶核酸分子进行荧光标记，使靶核酸分子上标记荧光报告分子；核酸探针分子与待测的靶核酸分子杂交后，利用荧光微球的荧光信号实现对靶核酸分子的定性分析，利用报告分子的荧光强度实现对靶核酸分子的定量/半定量检测。应用液相芯片可同时进行多样品检测，从而实现在一个样本中的多种核酸分子的多元定量分析。但是，目前的液相芯片技术尚存在以下缺陷：1、荧光染料斯托克斯位移一般不超过30nm，荧光染料易淬灭、信号不稳定，且不利于实现不同荧光信号之间的区分；2、液相芯片中需要预先制作荧光微球，再以荧光微球偶联探针分子，导致液相芯片的制作步骤繁琐，另外，受到荧光微球中荧光信号种类的限制，目前仅能实现对100种左右探针分子的荧光标记。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中荧光标记的探针分子存在荧光信号不稳定、无法有效区分不同的荧光信号，以及标记探针分子的荧光信号种类少的缺陷。为此，本专利技术提供了下述技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种荧光标记的核苷酸，具有式I所示的结构：其中，W为dNTP，所述dNTP选自dUTP、dATP、dGTP、dCTP和dTTP中的一种，X为卤素，R1选自烷基、环烷基、芳基和杂环基中的一种。优选地，上述的荧光标记的核苷酸，所述X为Br。优选地，上述的荧光标记的核苷酸，具有式II所示的结构：进一步优选地，上述的荧光标记的核苷酸，其结构如式A～式H所示：第二方面，本专利技术提供了一种制备上述的荧光标记的核苷酸的方法，包括如下步骤：S1.将化合物dN-I与1,6-庚二炔在催化剂作用下，进行交叉偶联反应，制得化合物dN-P，然后将化合物dN-P与三正丁胺焦磷酸盐和2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮的共同作用下发生反应，得化合物dNTP-P；其中，dN-I选自如下所示的化学结构：dN-P选自如下所示的化学结构：dNTP-P选自如下所示的化学结构：S2.式Q所示结构的化合物与2-叠氮乙胺发生缩合反应，制得化合物Q-N3，化合物Q的结构如下所示：化合物Q-N3的结构如下所示：S3.将化合物Q-N3与化合物dNTP-P进行点击化学反应，制得式I所示结构的荧光标记的核苷酸。优选地，上述的制备方法，所述式Q所示结构的化合物通过如下步骤制备：(1)中间体I’-1制备将苯肼加入冰乙酸中，搅拌，缓慢滴加3-甲基-2-丁酮，滴加完毕后加热至60-65℃，反应3-4小时，萃取，浓缩，精制，得到中间体I’-1；其中，苯肼和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1：(1.0-1.2)；(2)中间体I’-2制备将中间体I’-1和1,2-二溴乙烯加入甲苯中，氮气保护，加热回流反应16-18小时，冷却，析出固体，即中间体I’-2；其中，中间体I’-1和1,2-二溴乙烯的摩尔比为1：(1.5-2.0)；(3)中间体I’-4制备将干燥的N，N-二甲基甲酰胺加到干燥的二氯甲烷中，冰浴下加入三氯氧磷的二氯甲烷溶液，搅拌，加入环己酮，撤去冰浴，加热回流反应2-3小时，将反应液倒入碎冰中，静置过夜，析出固体，即中间体I’-4；其中，环己酮、N，N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷的摩尔比为1：(1.0-1.1)：(1.0-1.05)；(6)中间体I’-5制备将中间体I’-2和中间体I’-4加至正丁醇和甲苯的混合液中，加热回流2-3小时，析出固体，过滤得到中间体I’-5；(7)化合物Q制备将中间体I’-5与Br-R1-COOH发生氨基取代反应，反应过程中加入NaOH，生产化合物Q；合成路线如下所示：进一步优选地，上述的制备方法：所述步骤(1)中，所述苯肼和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1：(1.0-1.2)；所述步骤(2)中，所述中间体I’-1和1,2-二溴乙烯的摩尔比为1：(1.5-2.0)；所述步骤(3)中，所述环己酮、N，N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷的摩尔比为1：(1.0-1.1)：(1.0-1.05)。优选地，上述的制备方法，所述步骤S3中，所述化合物I’-N3与所述化合物dNTP-P加入的摩尔比为1：(1～1.2)。第三方面，本专利技术提供了上述的荧光标记的核苷酸在制备荧光探针中的用途。第四方面，本专利技术提供了上述的荧光标记的核苷酸在基因测序、原位杂交检测、Northernblot、Southernblot或液相芯片中的用途。本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的一种荧光标记的核苷酸，具有式I所示的结构。式I所示结构的化合物由脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)与式Q所示的荧光染料共价结合形成，其中式Q所示的荧光染料分子的斯托克斯位移大，荧光信号稳定，荧光量子产率高，能够与其他荧光染料分子的发射荧光有效区分开，在荧光成像时具有信噪比高的优点。式I所示的荧光标记的核苷酸在血清等检测环境中的稳定性高，能够在细胞中长时间保留，同时荧光标记的核苷酸细胞毒性低、生物相容性高，适于可广泛应用于细胞内外生物活性分子检测、组织及活体动物标记成像、药物分析、病理模型研究及疾病早期诊断等。荧光标记的核苷酸可以直接用于核酸分子的合成，由于染料分子是直接与核苷酸共价偶联的，因此合成的核酸不需要进行荧光偶联修饰，即可发射荧光，作为荧光探针用于细胞内外或者生物活体内的目标生物分子(蛋白、DNA或RNA等)的检测。上述的荧光探针具有荧光量子产率高、荧光性能稳定的优势，同时，在合成荧光探针时，可以灵活地在核酸分子链的特定位置上引入所需数量的上述荧光标记的核苷酸，一方面可以保证合成的具有荧光性能的核酸分子的生物活性，另一方面可以通过引入特定数量的荧光染料分子以控制荧光信号强度。上述荧光标记的核苷酸在应用于液相芯片时，以荧光标记的核苷酸合成的探针分子，无需与荧光微球偶联，简化了液相芯片的制备过程；并且为液相芯片在近红外区域提供了一种新的信号稳定且区分度高的荧光检测信号，增加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光标记的核苷酸，其特征在于，具有式I所示的结构：

【技术特征摘要】
1.一种荧光标记的核苷酸，其特征在于，具有式I所示的结构：其中，W为dNTP，所述dNTP选自dUTP、dATP、dGTP、dCTP和dTTP中的一种，X为卤素，R1选自烷基、环烷基、芳基和杂环基中的一种。2.根据权利要求1所述的荧光标记的核苷酸，其特征在于，所述X为Br。3.根据权利要求1或2所述的荧光标记的核苷酸，其特征在于，具有式II所示的结构：4.根据权利要求3所述的荧光标记的核苷酸，其特征在于，其结构如式A～式H所示：5.一种制备权利要求1所述的荧光标记的核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.将化合物dN-I与1,6-庚二炔在催化剂作用下，进行交叉偶联反应，制得化合物dN-P，然后将化合物dN-P与三正丁胺焦磷酸盐和2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮的共同作用下发生反应，得化合物dNTP-P；其中，dN-I选自如下所示的化学结构：dN-P选自如下所示的化学结构：dNTP-P选自如下所示的化学结构：S2.式Q所示结构的化合物与2-叠氮乙胺发生缩合反应，制得化合物Q-N3，化合物Q的结构如下所示：化合物Q-N3的结构如下所示：S3.将化合物Q-N3与化合物dNTP-P进行点击化学反应，制得式I所示结构的荧光标记的核苷酸。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述式Q所示结构的化合物通过如下步骤制备：(1)中间体I’-1制备将苯肼加入冰乙酸中，搅拌，缓慢滴加3-甲基-2-丁酮，滴加完毕后加热至60-65℃，反应3-4小时，萃取，浓缩，精制，得到中间体I’-1；其中，苯肼和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为1：(1.0-1.2)；(2)中间体I’-2制备将中间体I’-1和1,2-二溴乙烯加...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，兰州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32