RSV F蛋白突变体制造技术

本公开涉及RSV F蛋白突变体、编码RSV F蛋白突变体的核酸或载体、包含RSV F蛋白突变体或核酸的组合物，和所述RSV F蛋白突变体、核酸或载体和组合物的用途。

Mutant of RSV F protein

The present disclosure relates to RSV F protein mutants, nucleic acids or vectors encoding RSV F protein mutants, compositions containing RSV F protein mutants or nucleic acids, and uses of the RSV F protein mutants, nucleic acids or vectors and compositions.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】RSVF蛋白突变体相关申请本申请要求2015年12月23日提交的美国临时申请号62/387,270和2016年11月11日提交的美国临时申请号62/421,184的优先权。前述申请各自的完整内容通过引用并入本文。专利
本专利技术一般涉及疫苗且具体涉及针对呼吸道合胞病毒的疫苗。专利技术背景呼吸道合胞病毒或RSV是感染肺和呼吸道的呼吸道病毒。RSV是世界范围内婴儿中严重病毒性下呼吸道疾病的主要原因且是老人的呼吸疾病的重要原因。然而，尚未批准疫苗用于预防RSV感染。RSV是副粘液病毒科(Paramyxoviridae)的成员。其基因组由编码11种蛋白(包括9种结构蛋白(3种糖蛋白和6种内部蛋白)和两种非结构蛋白)的单链负义RNA分子组成。结构蛋白包括3种跨膜表面糖蛋白：附着蛋白G、融合蛋白F和小疏水SH蛋白。存在两种RSV亚型，A和B。其差异主要在于G糖蛋白，而F糖蛋白的序列在两种亚型之间更保守。成熟F糖蛋白具有三个一般结构域：胞外结构域(ED)、跨膜结构域(TM)和胞质尾区(CT)。CT含有单一棕榈酰基化半胱氨酸残基。人RSV的F糖蛋白首先从mRNA翻译为单一574个氨基酸的多肽前体(称为“F0”或“F0前体”)，其含有N-末端的信号肽序列(氨基酸1-25)。翻译后，在内质网中通过信号肽酶移除信号肽。F0前体的剩余部分(即，残基26-574)可通过细胞蛋白酶(尤其弗林蛋白酶)在两个多基础位点(a.a.109/110和136/137)进一步切割，移除命名为pep27的27个氨基酸的间插序列(氨基酸110-136)且生成两个命名为F1(C-末端部分；氨基酸137-574)和F2(N-末端部分；氨基酸26-109)的连接的片段。F1含有其N-末端的疏水融合肽和两个七肽重复区(HRA和HRB)。HRA靠近融合肽，且HRB靠近TM结构域。F1和F2片段通过两个二硫键连接在一起。无信号肽序列的未切割的F0蛋白或F1-F2异二聚体可形成RSVF原体。3个此类原体组装以形成最终RSVF蛋白复合物，其为3个原体的同三聚体。亚型A和B的F蛋白的氨基酸序列约90%相同。A亚型的F0前体多肽的实例序列提供于SEQIDNO:1(A2毒株；GenBankGI：138251；SwissProtP03420)中，且B亚型的F0前体多肽的实例序列提供于SEQIDNO:2(18537毒株；GenBankGI：138250；SwissProtP13843)中。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2两者都是574个氨基酸的序列。SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的信号肽序列也已报导为氨基酸1-25(GenBank和UniProt)。在两个序列中，TM结构域是近似氨基酸530至550，但替代地报导为525-548。胞质尾区在氨基酸548或550开始并在氨基酸574结束，其中棕榈酰基化半胱氨酸残基位于氨基酸550。探索用于RSV亚单位疫苗的一级抗原之一是F蛋白。RSVF蛋白三聚体介导病毒粒子膜和宿主细胞膜之间的融合且也促进合胞体的形成。在与宿主细胞膜融合之前的病毒粒子中，最大F分子群体形成棒棒糖形结构，其中TM结构域锚定于病毒包膜中[Dormitzer,P.R.,Grandi,G.,Rappuoli,R.,NatureReviewsMicrobiol,10,807,2012.]。该构型被称为融合前构型。融合前RSVF由单克隆抗体(mAb)D25、AM22和MPE8识别，在寡聚状态之间无差别。融合前F三聚体由mAbAM14特异性识别[GilmanMS,MoinSM,MasV等人Characterizationofaprefusion-specificantibodythatrecognizesaquaternary,cleavage-dependentepitopeontheRSVfusionglycoprotein.PLoSPathogens,11(7),2015]。在RSV进入细胞中期间，F蛋白从融合前状态(其在本文中可称为“F前”)通过中间延伸结构重排为融合后状态(“F后”)。在该重排期间，融合前分子的C-末端卷曲螺旋解离为其三条组成链，然后其在球形头周围卷绕并接合三个另外的螺旋以形成融合后六螺旋束。如果融合前RSVF三聚体经受越来越苛刻的化学或物理条件，诸如升温，则其经历结构变化。首先，三聚体结构(至少在分子内局部地)损失，且然后重排为融合后形式，且然后结构域变性。为了防止病毒进入，在病毒包膜与细胞膜融合之前，F特异性中和抗体据推测必须结合病毒粒子上F的融合前构型，或潜在地延伸的中间体。因此，将F蛋白的融合前形式被视为作为期望疫苗抗原的优选构型[Ngwuta,J.O.,Chen,M.,Modjarrad,K.,Joyce,M.G.,Kanekiyo,M.,Kumar,A.,Yassine,H.M.,Moin,S.M.,Killikelly,A.M.,Chuang,G.Y.,Druz,A.,Georgiev,I.S.,Rundlet,E.J.,Sastry,M.,Stewart-Jones,G.B.,Yang.Y.,Zhang,B.,Nason,M.C.,Capella,C.,Peeples,M.,Ledgerwood,J.E.,Mclellan,J.S.,Kwong,P.D.,Graham,B.S.,ScienceTranslat.Med.,14,7,309(2015)]。在用表面活性剂诸如TritonX-100、TritonX-114、NP-40、Brij-35、Brij-58、Tween20、Tween80、辛基葡糖苷、辛基硫代葡糖苷、SDS、CHAPS、CHAPSO从膜提取，或表达为胞外结构域，物理或化学应激或储存后，F糖蛋白容易转化为融合后形式[McLellanJS,ChenM,LeungS等人StructureofRSVfusionglycoproteintrimerboundtoapre-fusion-specificneutralizingantibody.Science340,1113–1117(2013);Chaiwatpongsakorn,S.,Epand,R.F.,Collins,P.L.,EpandR.M.,Peeples,M.E.,JVirol.85(8):3968-77(2011);Yunus,A.S.,,JacksonT.P.,Crisafi,K.,Burimski,I.,Kilgore,N.R.,Zoumplis,D.,Allaway,G.P.,Wild,C.T.,Salzwedel,K.Virology.2010Jan20;396(2):226-37]。因此，将融合前F制备为疫苗抗原仍然是挑战。由于通过干扰病毒进入的中和和保护性抗体功能，假定预期仅引发融合后特异性抗体的F抗原无法与引发融合前特异性抗体的F抗原一样有效。因此，认为更可期望利用含有呈融合前形式(或潜在地延伸的中间体形式)的F蛋白免疫原的F疫苗。迄今的努力仍未得到已在临床中显示引发足够保护水平以支持授予RSV疫苗许可证的RSV疫苗。因此，需要衍生自RSVF蛋白的免疫原，其与相应的天然RSVF蛋白相比具有改善的特性，诸如融合前形式的增强本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.野生型RSV F蛋白的突变体，所述突变体包含F1多肽和F2多肽，其中所述突变体相对于所述野生型RSV F蛋白的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，且其中所述氨基酸突变选自：(1) 工程改造的二硫键突变；(2) 空腔填充突变；(3) 静电突变；(4) 至少一个工程改造的二硫化物突变和至少一个空腔填充突变的组合；(5) 至少一个工程改造的二硫化物突变和至少一个静电突变的组合；(6) 至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合；和(7) 至少一个工程改造的二硫化物突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.23 US 62/387270;2016.11.11 US 62/4211841.野生型RSVF蛋白的突变体，所述突变体包含F1多肽和F2多肽，其中所述突变体相对于所述野生型RSVF蛋白的氨基酸序列包含至少一个氨基酸突变，且其中所述氨基酸突变选自：(1)工程改造的二硫键突变；(2)空腔填充突变；(3)静电突变；(4)至少一个工程改造的二硫化物突变和至少一个空腔填充突变的组合；(5)至少一个工程改造的二硫化物突变和至少一个静电突变的组合；(6)至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合；和(7)至少一个工程改造的二硫化物突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合。2.根据权利要求1所述的突变体，其中所述氨基酸突变包含至少一个工程改造的二硫化物突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合。3.根据权利要求1所述的突变体，其呈三聚体的形式。4.根据权利要求1所述的突变体，其与相应的野生型RSVF蛋白相比具有增加的稳定性，其中所述稳定性通过所述突变体与抗体AM14的结合来测量。5.根据权利要求1-4中任一项所述的突变体，其中所述野生型RSV是亚型A、亚型B、毒株A2、毒株Ontario或毒株BuenosAires。6.根据权利要求1-5中任一项所述的突变体，其中所述工程改造的二硫化物突变选自：S55C和L188C；S155C和S290C；T103C和I148C；以及L142C和N371C。7.根据权利要求1-5中任一项所述的突变体，其中所述空腔填充突变选自：(1)位置55、62、155、190或290的S被I、Y、L、H或M取代；(2)位置54、58、189、219或397的T被I、Y、L、H或M取代；(3)位置151的G被A或H取代；(4)位置147或298的A被I、L、H或M取代；(5)位置164、187、192、207、220、296、300或495的V被I、Y、H取代；和(6)位置106的R被W取代。8.根据权利要求1-5中任一项所述的突变体，其中所述静电突变选自：(1)位置82、92或487的E被D、F、Q、T、S、L或H取代；(2)位置315、394或399的K被F、M、R、S、L、I、Q或T取代；(3)位置392、486或489的D被H、S、N、T或P取代；和(4)位置106或339的R被F、Q、N或W取代。9.根据权利要求1-5中任一项所述的突变体，其中所述氨基酸突变是至少一个工程改造的二硫化物突变、至少一个空腔填充突变和至少一个静电突变的组合，且其中：(i)所述工程改造的二硫化物突变选自：55C和188C；155C和290C；103C和148C；以及142C和371C，(ii)所述空腔填充突变选自：(1)位置55、62、155、190或290的S被I、Y、L、H或M取代；(2)位置54、58、189、219或397的T被I、Y、L、H或M取代；(3)位置151的G被A或H取代；(4)位置147或298的A被I、L、H或M取代；(5)位置164、187、192、207、220、296、300或495的V被I、Y、H取代；和(6)位置106的R被W取代；且(iii)所述静电突变选自：(1)位置82、92或487的E被D、F、Q、T、S、L或H取代；(2)位置315、394或399的K被F、M、R、S、L、I、Q或T取代；(3)位置392、486或489的D被H、S、N、T或P取代；和(4)位置106或339的R被F、Q、N或W取代。10.根据权利要求9所述的突变体，其中所述氨基酸突变是选自以下的突变的组合：(1)T103C、I148C、S190I和D486S的组合；(2)T54H、S55C、L188C、D486S的组合；(3)T54H、T103C、I148C、S190I、V296I和D486S的组合；(4)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I和N371C的组合；(5)S55C、L188C和D486S的组合；(6)T54H、S55C、L188C和S190I的组合；(7)S55C、L188C、S190I和D486S的组合；(8)T54H、S55C、L188C、S190I和D486S的组合；(9)S155C、S190I、S290C和D486S的组合；(10)T54H、S55C、L142C、L188C、V296I、N371C、D486S、E487Q和D489S的组合；和(11)T54H、S155C、S190I、S290C和V296I的组合。11.根据权利要求1所述的突变体，其中所述突变体包含位置103(103C)和位置148(148C)的半胱氨酸(C)、位置190的异亮氨酸(I)(190I)和位置486的丝氨酸(S)(486S)，且其中所述突变体包含选自以下的F1多肽和F2多肽：(1)包含SEQIDNO:41的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:42的氨基酸序列的F1多肽；(2)包含与SEQIDNO:41的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:42的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(3)包含SEQIDNO:43的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:44的氨基酸序列的F1多肽；(4)包含与SEQIDNO:43的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:44的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(5)包含SEQIDNO:45的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:46的氨基酸序列的F1多肽；(6)包含与SEQIDNO:45的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:46的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(7)包含SEQIDNO:47的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:48的氨基酸序列的F1多肽；(8)包含与SEQIDNO:47的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:48的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(9)包含SEQIDNO:49的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:50的氨基酸序列的F1多肽；(10)包含与SEQIDNO:49的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:50的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(11)包含SEQIDNO:279的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:280的氨基酸序列的F1多肽；(12)包含与SEQIDNO:279的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:280的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(13)包含SEQIDNO:281的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:282的氨基酸序列的F1多肽；(14)包含与SEQIDNO:281的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:282的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(15)包含SEQIDNO:283的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:284的氨基酸序列的F1多肽；(16)包含与SEQIDNO:283的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:284的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(17)包含SEQIDNO:285的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:286的氨基酸序列的F1多肽；(18)包含与SEQIDNO:285的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:286的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(19)包含SEQIDNO:287的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:288的氨基酸序列的F1多肽；(20)包含与SEQIDNO:287的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:288的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(21)包含SEQIDNO:289的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:290的氨基酸序列的F1多肽；和(22)包含与SEQIDNO:289的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:290的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽。12.根据权利要求1所述的突变体，其中所述突变体包含位置54的组氨酸(H)、位置103和148的半胱氨酸(C)、位置190和296的异亮氨酸(I)和位置486的丝氨酸(S)，且其中所述突变体包含选自以下的F1多肽和F2多肽：(1)包含SEQIDNO:51的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:52的氨基酸序列的F1多肽；(2)包含与SEQIDNO:51的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:52的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(3)包含SEQIDNO:53的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:54的氨基酸序列的F1多肽；(4)包含与SEQIDNO:53的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:54的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(5)包含SEQIDNO:55的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:56的氨基酸序列的F1多肽；(6)包含与SEQIDNO:55的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:56的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(7)包含SEQIDNO:57的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:58的氨基酸序列的F1多肽；(8)包含与SEQIDNO:57的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:58的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(9)包含SEQIDNO:59的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:60的氨基酸序列的F1多肽；(10)包含与SEQIDNO:59的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:60的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(11)包含SEQIDNO:291的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:292的氨基酸序列的F1多肽；(12)包含与SEQIDNO:291的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F2多肽和包含与SEQIDNO:292的氨基酸序列具有至少97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的F1多肽；(13)包含SEQIDNO:293的氨基酸序列的F2多肽和包含SEQIDNO:294的氨基酸序列的F1多肽；(14)包含与SEQIDNO:293...

【专利技术属性】
技术研发人员：车晔，PR多尔米策尔，AV格里本科，LD汉克，AK普拉萨，邱夏杨，ME鲁彭，宋曦，KA斯万森，S科达利，徐欣，KS埃菲仁，蔡平，KR汤金斯，LDP努涅斯，
申请(专利权)人：辉瑞公司，
类型：发明
国别省市：美国,US