金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物、试剂盒及其检测方法技术

技术编号:19310192 阅读:197 留言:0更新日期:2018-11-03 06:26
本发明专利技术公开了一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物、试剂盒及其检测方法。该引物包括锁式探针引物,以及RCA检测引物padF和padR;其中:锁式探针引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;RCA检测引物padF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;RCA检测引物padR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术利用锁式探针能与模板DNA互补结合的特点,在金葡菌特异性基因片段序列上设计锁式探针,通过引物进行滚环扩增,建立金葡菌滚环扩增检测方法,可以缩短传统金葡菌检测的周期,同时确保检测的特异性和灵敏度。这对于提高重大群体疾病诊断率,早期的疾病诊断具有非常重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物、试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物
,特别涉及一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
食源性感染和疾病到目前为止仍然是每一个人所关注的热点问题,这些疾病的产生大部分是由于摄入了被病原性微生物所污染的食品。食源性致病菌每年会造成1400万疾病案例,6万例院内治疗及1800人的死亡。葡萄球菌食物性中毒是最重要的食源性疾病之一,是世界范围内公共卫生的主要问题。据统计在1983年~1997年间,美国每年由葡萄球菌所引起的食物性中毒的案例数达到185001750例的院内治疗及2起死亡,造成了1.5亿美元的经济损失。在一些大型群体疾病爆发的案例中,金黄色葡萄球菌的检出率甚至达到了90%。然而,尽管缺乏相对全面的监测和调查,由金黄色葡萄球菌所引起的食物性中毒案例的数量也因为每个地区不同的饮食习惯有所差异。金黄色葡萄球菌在摄入人体之后会产生肠毒素(SEs),这种毒素会导致病人呕吐及腹泻,是金黄色葡萄球菌引起食物中毒的主要原因。尽管由金黄色葡萄球菌所造成的污染可以通过加热食品的方式来避免,然而其能够在很广泛的温度(7~48.5℃)和pH范围内(4.2~9.3)生长,如此将有利于其造成污染及其在不同类型的食品之间传播。在食品中葡萄球菌的浓度达到106~108CFU/g时会引起食物中毒,对于一些对金黄色葡萄球菌敏感人群在葡萄球浓度达到105CFU/g时由于其产生了足够的肠毒素导致了一些临床症状的产生。虽然目前监管机构已经严格限制了在一些开袋即食食品中不能存在金黄色葡萄球菌,在未加工的食品中所允许的浓度范围在102~103CFU/g。金葡菌的常规检测诊断与鉴定的主要过程包括:菌悬液制备,选择性培养基分离纯化获取单菌落,目标菌落接种至液体培养基中,生化实验检测。常规的实验检测鉴定方法所需时间较长,由营养不足及物种之间的竞争会导致一些假阳性的结果出现,同时由于其较低的灵敏度已经引起了人们对于这种传统的鉴定方法的担忧。在过去的研究中,学者基于PCR或者RQ-PCR(real-timequantitativePCR)的方法用来快速检测与鉴定食源性病原微生物。但是,PCR方法对仪器设备(如PCR仪)要求高、投入大,给技术的基层推广造成了极大障碍。由于在反应的过程中容易发生错配现象及检出限较高,同时实时定量PCR所需要专业的技术人员等都对其应用推广造成了极大的障碍。滚环扩增技术(RCA)是一种新型的核酸扩增技术。该技术模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程,在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下由一条引物即可引发沿环形DNA模板的链置换合成,实现环状DNA模板的体外等温扩增。在此基础上增加一条与DNA模板序列一致的引物,RCA则可以实现模板的指数扩增。通过锁式探针与线性模板结合及连接酶连接成环的过程,RCA可以实现线性DNA或RNA模板的信号放大。该技术具有灵敏、特异、原理简单和操作简便的特点,已被用于环状DNA的扩增、基因测序、基因表达图谱制作等。但到目前为止,尚未有基于滚环扩增检测金黄色葡萄球菌方法,因此,建立一种针对金黄色葡萄球菌新型的具有独立知识产权的滚环扩增方法具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物。本专利技术的另一目的在于提供所述一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒。本专利技术的又一目的在于提供所述金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测方法。其具有灵敏度高、特异性好、操作简便,结果准确可靠,检测成本低等检测特点。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物,包括锁式探针引物(padlockprimer),以及RCA检测引物padF和padR,其核苷酸序列如下所示:锁式探针引物(padlockprimer):5’-CATTTTGCCGCTTGTTTCTTTGTCTGTGCAAAGATACGTTACACCGAATTCACCTCTACCGAGTTCACGACCGAGTTCGTAACGAGTTTCTGCATTCCGT-3’(SEQIDNO.1);RCA检测引物(padF):5’-TCTTTGTCTGTGCAAAGATACGTT-3’(SEQIDNO.2);RCA检测引物(padR):5’-AACTCGTTACGAACTCGGTC-3’(SEQIDNO.3)。一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒,包括上述金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物。所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物中锁式探针引物的浓度为100mM,RCA检测引物padF和padR的浓度均为10mM。所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒在检测金葡色葡萄球菌中的应用。一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测方法,包括如下步骤:(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA,并控制模板DNA水溶液的OD260/OD280值为1.8~2.0;(2)锁式探针的环化连接:将步骤(1)中提取的细菌DNA与上述锁式探针引物进行环化连接,其环化连接的反应体系为25μL反应体系:DNA模板2.5μL,40U/μLTaqDNAligasebuffer2.5μL,100mM锁式探针引物2.5μL,无菌去离子水补充至25μL;(3)未环化锁式探针的消化:步骤(2)中的环化连接反应完成后,立即将产物冰浴5min,然后再加入预混液,于37℃条件下水浴3h,再于80℃条件下水浴20min;其中,预混液的组成为:5U/μL核酸外切酶Ⅲ2.5μL,10×核酸外切酶Ⅲ缓冲液5μL,10U/μL核酸外切酶Ⅰ2.5μL,10×核酸外切酶Ⅰ缓冲液5μL,无菌去离子水10μL;(4)RCA扩增:将步骤(3)中消化后的产物进行RCA扩增,先于58℃恒温条件下反应1h,然后在80℃条件下反应20min,反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳;若电泳结果出现梯形条带,则说明检测菌株为金黄色葡萄球菌,反之则不是金黄色葡萄球菌;其中,所述的RCA扩增的体系为25μL反应体系:步骤(3)中消化后的产物10μL,10×BstDNApolymerasebuffer2.5μl,10μmol/LRCA检测引物padR2.5μL,10μmol/LRCA检测引物padF2.5μL,10mmol/LdNTPs2.5μL,8U/μLBstDNApolymerase0.625μL,ddH2O补充至25μL。步骤(2)中所述的锁式探针引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。步骤(2)中所述的环化连接的反应条件为:95℃5min,60℃60min,95℃15min灭活剩余连接酶。步骤(4)中所述的RCA检测引物padF的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示;RCA检测引物padR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。步骤(4)中所述的琼脂糖凝胶为浓度1.5%(w/v)的琼脂糖凝胶。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果:(1)与传统检测鉴定方法相比,本实验的灵敏度较高,较PCR检测方法灵敏度高100倍左右。特异性高,较好的解决了PCR检测过程中易出现的错配现象,避免出现假阳性的结果本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物,其特征在于:包括锁式探针引物(padlock primer),以及RCA检测引物padF和padR;其中:锁式探针引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;RCA检测引物padF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;RCA检测引物padR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物,其特征在于:包括锁式探针引物(padlockprimer),以及RCA检测引物padF和padR;其中:锁式探针引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;RCA检测引物padF的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示;RCA检测引物padR的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物。3.根据权利要求2所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒,其特征在于:所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测引物中锁式探针引物的浓度为100mM,RCA检测引物padF和padR的浓度均为10mM。4.权利要求2或3所述的金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测试剂盒在检测金葡色葡萄球菌中的应用。5.一种金黄色葡萄球菌的滚环扩增快速检测方法,其特征在于:包括如下步骤:(1)提取待检样品的细菌DNA作为模板DNA;(2)锁式探针的环化连接:将步骤(1)中提取的细菌DNA与锁式探针引物进行环化连接,其环化连接的反应体系为25μL反应体系:DNA模板2.5μL,40U/μLTaqDNAligasebuffer2.5μL,100mM锁式探针引物2.5μL,无菌去离子水补充至25μL;(3)未环化锁式探针的消化:步骤(2)中的环化连接反应完成后,立即将产物冰浴5min,然后再加入...

【专利技术属性】
技术研发人员:徐振波徐行勇包雪蕊刘君彦苗健刘丽艳苏健裕李冰李琳
申请(专利权)人:华南理工大学
类型:发明
国别省市:广东,44

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