对昆虫蛋白或昆虫表达系统表达的外源蛋白进行标记的方法技术方案

本发明专利技术涉及一种对昆虫来源的蛋白进行标记的方法。所述方法借助昆虫自身代谢通路将叠氮修饰的全乙酰化N‑乙酰氨基葡萄糖掺入至昆虫表达的蛋白的糖基，随后通过点击化学反应，将可检测标记物偶联至蛋白，从而实现对昆虫来源的蛋白的标记。所述方法可用于原位标记昆虫细胞或标记昆虫表达系统所表达的外源蛋白。

【技术实现步骤摘要】
对昆虫蛋白或昆虫表达系统表达的外源蛋白进行标记的方法
本专利技术涉及通过生物正交反应对昆虫来源的蛋白进行标记的方法。该方法可实现昆虫细胞中的蛋白的原位标记，也可实现对昆虫杆状病毒表达系统所表达的外源蛋白进行标记。
技术介绍
蛋白是细胞内最丰富的生物大分子，它几乎参与所有的生命过程。因此，对蛋白的结构、功能和相互作用的研究是生命科学领域的一项重要任务。在很多情况下，需要对蛋白进行标记来实现实时和/或定量的观测。目前最常用的标记蛋白的方法包括荧光蛋白(fluorescentprotein)、放射性同位素以及通过化学反应将荧光基团非特异性地修饰至蛋白中的赖氨酸或酪氨酸。然而，这些方法往往操作复杂，还可能对蛋白的结构、功能和定位产生影响。针对传统方法的上述缺陷，近十几年来发展的生物正交反应为蛋白的标记或修饰提供了新的可能。生物正交反应是指具有如下特征的化学反应：在生理条件下进行，不干扰同时发生的其它生化反应或各种生物内源过程，且不会对生物体及生物内源分子造成损伤。就借助生物正交反应实现蛋白标记而言，首先将生物正交反应基团引入蛋白，借助该正交反应基团与带有互补反应基团的标记物进行反应，将不同的标记物(例如荧光或免疫印迹标记物)偶联至蛋白，从而实现蛋白定位和功能的检测。目前最常用的生物正交反应基团对包括能够发生点击化学(ClickChemistry)反应的叠氮基-炔基以及叠氮基-三芳基膦。其中，叠氮基与三芳基膦发生的施陶丁格反应(StaudingerLigation)或与炔基发生的环加成反应均能将与该生物正交反应基团对中的一个成员相连的蛋白偶联至与该生物正交反应基团对中的另一成员相连的可检测标记物，实现将可检测标记物修饰至蛋白的目的。其中，叠氮基团与高张力炔烃的环加成反应(Strain-promotedazide-alkynecycloaddition，SPAAC)因其不需要添加催化剂而成为研究和应用热点。最近发展了借助生物糖代谢途径将化学探针引入蛋白的策略。其以化学生物学方法为切入点，通过对非天然糖进行设计，在蛋白的糖链中引入生物正交反应基团，并借助生理条件下的生物正交反应引入探针分子。该方法能够在分子水平上揭示糖蛋白的定位与功能。然而，这种方法多用于哺乳动物细胞蛋白的标记。目前还未有利用非天然糖的生物正交反应对昆虫细胞或昆虫表达系统表达的蛋白进行标记的报道。昆虫杆状病毒表达系统(BaculovirusExpressionVectorSystems，BEVS)是目前应用广泛的蛋白表达体系，具有效率高、周期短、成本低等优点。此外，宿主昆虫细胞能够以多种复杂方式对合成的蛋白进行翻译后修饰，表达的重组蛋白在细胞内被折叠、修饰、运输、组装成最终的功能蛋白。其中，蛋白N-糖基化修饰是昆虫杆状病毒表达系统的重要特征，这对很多蛋白的正确折叠和发挥生物功能具有重要意义。然而，目前对昆虫蛋白进行标记的方法极少。最近报道了通过对宿主细胞进行遗传工程操作，使得宿主细胞能够表达将带有生物正交基团的非天然氨基酸插入肽链的氨酰tRNA合成酶；进而对目的蛋白的编码序列进行改造，将特定位点的核苷酸序列突变为琥珀终止子(UAG)，从而将该非天然氨基酸插入到目标蛋白的该特定位点，由此实现利用该非天然氨基酸对目标蛋白进行标记。然而，该方法操作复杂，实施周期长，不利于推广。因此，仍存在对用于昆虫细胞和昆虫杆状病毒表达系统表达的蛋白进行标记的简捷方法的需求。
技术实现思路
针对本领域的上述问题，一方面，本专利技术提供了一种对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的方法，所述方法包含如下步骤：(i)在昆虫细胞培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液；(ii)收集步骤(i)得到的细胞悬液，离心，得到所述细胞的沉淀；(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀中的细胞进行固定；(iv)向步骤(iii)的经固定的细胞中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白；(v)对所述可检测标记物进行检测。另一方面，本专利技术提供了一种对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记的方法，所述方法包含如下步骤：(a)将昆虫细胞在培养基中培养至对数期，随后在新鲜培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，并加入杆状病毒进行培养得到昆虫细胞悬液，其中，所述杆状病毒的基因组携带表达所述目的蛋白的核酸序列；(b)收集步骤(a)得到的昆虫细胞悬液，离心、过滤，收集上清液；(c)对步骤(b)收集的上清液实施目的蛋白的纯化；(d)向步骤(c)的经纯化的蛋白添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述蛋白；(e)对所述可检测标记物进行检测。又一方面，本专利技术提供了叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖用于对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的用途，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖被掺入至所述糖蛋白的糖基；并且其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖的叠氮基与炔基或三芳基膦的生物正交反应而实现对昆虫细胞中的糖蛋白的原位标记。另一方面，本专利技术提供了叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖用于对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记的用途，其中，所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖被掺入至所述目的蛋白的糖基；并且其中，通过所述叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖的叠氮基与炔基或三芳基膦的生物正交反应而实现对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白的标记。附图说明图1为根据实施例1，利用不同浓度的Ac4GlcNAz、DBCO-PEG4-biotin和FITC-链霉亲和素对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的荧光结果图。第一行显示FITC通道；第二行显示DAPI通道；第三行显示明场、FITC通道和DAPI通道叠加的图。图2为根据比较例1，利用不同浓度的Ac4ManNAz、DBCO-PEG4-biotin和FITC-链霉亲和素对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的荧光结果图。第一行显示FITC通道；第二行显示DAPI通道；第三行显示明场、FITC通道和DAPI通道叠加的图。图3为根据实施例2，利用Ac4GlcNAz、DBCO-PEG4-biotin和HRP-链霉亲和素对昆虫杆状病毒表达系统所表达的N8蛋白和N8-N3蛋白(即，掺入了非天然糖的N8蛋白)进行标记的免疫印迹结果。具体实施方式本专利技术通过糖生物代谢途径将非天然糖引入昆虫细胞和昆虫杆状病毒表达系统表达的蛋白的糖链中，随后利用叠氮基与炔基或三芳基膦的生物正交反应，在温和的生理条件下将可检测标记物偶联至昆虫来源的蛋白，实现对昆虫细胞表达的蛋白进行标记(例如对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记)或对昆虫杆状病毒表达系统表达的外源蛋白进行标记。本专利技术的方法无需改造宿主昆虫细胞或目的蛋白的氨基酸序列，具有操作简便、不影响外源蛋白的功能和结构以及表达量等优点，有助于实现对目的蛋白的快速、便捷标记。不希望被理论所限地，本专利技术选取叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖来掺入蛋白的糖基是基于如下的考虑：在利用生物正交反应对哺乳动物细胞进行标记时，因为哺乳动物细胞表面以及其表达的外泌蛋白的糖链主要为末端唾液酸化的N-糖链，因此常使用经叠氮基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的方法，所述方法包含如下步骤：(i)在昆虫细胞培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N‑乙酰氨基葡萄糖，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液；(ii)收集步骤(i)得到的细胞悬液，离心，得到所述细胞的沉淀；(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀中的细胞进行固定；(iv)向步骤(iii)的经固定的细胞中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白；(v)对所述可检测标记物进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种对昆虫细胞中的糖蛋白进行原位标记的方法，所述方法包含如下步骤：(i)在昆虫细胞培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，将昆虫细胞接种入所述培养基中并对所述昆虫细胞进行培养，得到细胞悬液；(ii)收集步骤(i)得到的细胞悬液，离心，得到所述细胞的沉淀；(iii)对步骤(ii)获得的所述沉淀中的细胞进行固定；(iv)向步骤(iii)的经固定的细胞中添加连接有炔基或三芳基膦的可检测标记物，从而将所述标记物偶联至所述细胞内的糖蛋白；(v)对所述可检测标记物进行检测。2.一种对昆虫杆状病毒表达系统表达的目的蛋白进行标记的方法，所述方法包含如下步骤：(a)将昆虫细胞在培养基中培养至对数期，随后在新鲜培养基中添加叠氮修饰的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，并加入杆状病毒进行培养得到昆虫细胞悬液，其中，所述杆状病毒的基因组携带表达所述目的蛋白的核酸序列；(b)收集步骤(a)得到的昆虫细胞悬液，离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：李学兵，张振宁，傅立峰，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11